基因组DNA测序文库构建

1、基因组DNA测序文库构建1. 对收到的DNA羊品进行检测，取 2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含RNA或蛋白）的DNA羊品需要柱纯化后重新检测。对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。2. 用Qubit检测DNA羊品浓度。3. 吸取部分 DNA羊品，用 TE或Elution Buffer稀释，终浓度在 10ng/ul-30ng/ul 之间,体积为130ul。用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。4. 样品足够多的情况下

2、，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。M Sample5. 对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ulTE或Elution Buffer洗脱。回收产物用 Qubit测值。6. 修平和磷酸化100ul体系DNA1ug5 X T4 polymerase buffer20ulBSA (5mg/ml) 2ul ATP (100mm)1uldNTP( 10mm )10ulT4 DNA Polymerase (5U/ul)1ulKlenow (10U/ul )1ulT4 PNK (10U/ ul)1.5ul22° C反应2

3、0min，柱式法纯化，50-100ul TE 洗脱。纯化后 Qubit测值。7. 加 A'100ul 体系DNA0.5-2.5ug10 X klenow buffer10uldATP(10mm)1-3ulKlenow(exon-) (5U/ul )1-3ul37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。纯化后 Qubit测值。8. 连接头200ul 体系10 X T4 DNA ligase buffer 20ulPEG400030ulATP(100mm)2ulDNAX接头YT4 DNA ligase1.5-2ul加水至 200ulDNA与接头的摩尔比约在1:3

4、至1:10之间。9. 连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。10. PCR扩增10 X TagE buffer 5ul2+Mg2+4uldNTP(10mm) 1ullib-PCR-F0.5ullib-PCR-R0.5ultagE0.5ulDNA5ulddH2O33.5ul11. 琼脂糖胶回收。12. Qubit 测值，总量足够的情况下，取 3ul 跑胶检测。13. 附录T4 DNA Polymerase由于同时具有 5' 3'DNA聚合酶活性和 3'宀5'DNA外切酶活 性，可以用于将 5' 端突出末端补平或 3' 端突出末端削平。

5、 T4 DNA Polymerase 的 3't5'DNA外切酶活性对于单链 DNA要比双链DNA活性更高，即单链 DNA要比双链DNA 中的非配对链部分更容易被 T4 DNA Polymerase 所消化。 T4 DNA Polymerase 的 3' t5' 外切酶活性比 Klenow Fragment 要高约 200倍。DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段) 是 E. coliDNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物，具有 DNA 聚合酶活性和 3' t5' 核酸外切酶活性，但缺失了 5' t3' 核酸外切 酶活性。

6、Klenow 既保留了全酶的高保真性，又不会降解 DNA 5' 末端。注意：由于该 酶具有 3' t5' 核酸外切酶活性，升高反应温度、加入过量的酶、未加入dNTP 或反应时间过长均会导致 DNA 末端碱基被切除形成凹陷。T4多聚核苷酸激酶能够催化磷酸在ATP的丫 -位和寡核苷酸链(双链或单链DNA或RNA)的5 '-羟基末端以及3 '-单磷酸核苷间进行转移和交换，1个Richards。n 单位，指37 C条件下，30分钟内1 U催化1 nmol酸不溶性32P 掺 入所需要的酶量 。Klenow片段(3'宀5' exo )是大肠杆菌 DNA聚合酶I的蛋白水解产物。它保留 了 DNA聚合酶活性，但失去了5't 3'外切核酸酶活性。该酶经突变(D355A, E357A)去除了其3't5'的外切核酸酶活性(1) 。 1单位指在37°C条件下，30分钟内能使 10 nmol的dNTPs掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。注意：Klen