第四章大分子的分离和分析(精)

1、第四章大分子的分离和分析第一节DNA 的分离、检测和纯化本章摘要 DNA 的分离中，质粒的分离是最多的，主要使用碱裂解法。 DNA 凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和 PAGE 两种。从琼脂糖凝胶中回收 DNA 的方法很多， 根据待回收的 DNA 片段大小选择合适的方法。 RNA 的分离纯化主要是避免 RNA 酶的污染而降解目标分子。分子杂交根据杂交的对象可以分为Southern、Northern和Western杂交，分别是 DNA 和 DNA ， DNA 和 RNA ，蛋白质和蛋白质的杂交。杂交的过程分为：转膜、预杂交、杂交洗膜和检测等步骤。 DNA （或 RNA ）探针的标记方法很多，主要有：均匀

2、标记、单链探针标记和末端标记。 不同的标记方法适用于不同的分子， 标记方法不同要求的工具酶也不一样。常见的标记物有放射性同位素和生化酶两种。DNA是基因的物质载体，这些载体和基因绝大多数是以质粒的形式保存在大肠杆菌中，基因操作是从大肠杆菌开始的。一、 E.coli 质粒DNA 的分离和纯化1碱裂解法提取E.coli 质粒DNA的方法碱裂解法提取质粒DNA的方法是经典的方法，由 Birnboim和 Doly 设计并于1979 年发表。溶液（ solution）：悬浮细胞。该溶液中含有50mM 的葡萄糖。溶液 ： 2 倍溶液 体积。该溶液含有0.2N NaOH和 1% SDS 。在这种情况下，细胞

3、会很快破裂，使混浊的细胞悬液变成完全澄清的粘稠液体。此时，由于在pH12.0-12.5这样狭小的范围内，线性染色体DNA发生变性，而质粒DNA （ cccDNA ）不会变性。溶液 ： 1.5 倍溶液 体积。该溶液为高浓度的醋酸钾缓冲液（ 3M, pH4.6 ）。在中和过程中，高分子量的染色体DNA复性并聚积成不溶的沉淀，同时高浓度的盐引起蛋白质与SDS 复合物以及大分子的RNA形成沉淀。 而质粒DNA是环状的， 在变性之后经过中和仍保持环状，处于可溶解状态。经高速离心，上清液即为质粒DNA粗制品。2通过试剂盒分离纯化E.coli 质粒DNA操作过程如图4-1 。二、 DNA 的电泳检测1琼脂糖

4、凝胶电泳检测DNA是否真的存在， 是否有降解现象， DNA经限制性内切酶酶切后其产物的大小。目前最成熟的检测 DNA 的技术是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖从海藻中提取的一种线状高聚物，在 0.7% 的琼脂糖浓度下，对 0.8 10kb 的 DNA 有最佳的分离效果。上样缓冲液：含有40% 的蔗糖，用于将DNA样品沉积在点样孔内，使样品不易扩散；还含有溴酚兰等指示剂，用于观察电泳的进程。电压：DNA样品都是约pH8.0 进行保藏或分析的，在这一pH负电的。因此DNA的泳动方向是从负极走向正极。一般电场的大小为条件下，5 伏DNA是带/ 厘米左右。DNA构象：质粒DNA有三种构象，即闭合环状超螺旋（ c

5、cc型）、缺口环状（nick ）和线状，它们的泳动速率依次递减。染色：溴化乙啶可很好地掺入到双链DNA中，在紫外光的激发下会发出橙红色的荧光，可用于对DNA进行染色和观察。2聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳可很好的分离100bp-1kb 大小的核酸分子，对单链核酸来说，其分辨率可达1bp 。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N， N- 亚甲双丙烯酰胺经过聚合而成的高分子聚合物，其聚合度由浓度和二者的比例决定。一般在变性条件下使用，主要用来检测小分子核酸的大小，或在同位素标记的情况下分析单链核酸，如分离寡核苷酸探针、S1 核酸酶产物分析和 DNA测序等。三、 DNA 片段的纯化（从ag

6、aroe）1低熔点琼脂糖凝胶电泳法低熔点琼脂糖在水溶液中的溶解温度（ melting point ）很低，在65 以下；当温度降低到 20-30 时凝结成固形物。如果需要分离特定的DNA片段，可用低熔点琼脂糖凝胶进行分析，然后切割带有目标DNA的琼脂糖凝胶块，加入适量缓冲液，加热到60 ，凝胶溶化，DNA进入水溶液中，最后通过苯酚/ 氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的DNA片段。2透析袋电洗脱法将含有目标 DNA 片段的琼脂糖凝胶块切割下来， 放在透析袋中， 置于电泳缓冲液中电泳， DNA 将从凝胶块中 “跑 ”出来。常用于回收 5kb 以上的 DNA 片段。3 Glass Milk（ bead）结

7、合法琼脂糖凝胶在3 倍体积的3M NaI溶液作用下于55 会溶化， 从而将DNA释放到水溶液中；在这样的高盐浓度下，有一种硅珠 （ glass bead ，硅的细微颗粒，其水溶液呈牛奶状，故亦称玻璃奶， glass milk ）可特异性吸附 DNA 。当硅珠吸附 DNA 后，通过离心的方法很容易对硅珠进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的 DNA 洗脱出来。4 Qiagen纯化柱第一节RNA的分离、检测和纯化在细胞中除了DNA外还有 RNA,即 rRNA、 tRNA 和 mRNA。对于基因操作来说，涉及到的RNA主要是mRNA，而 mRNA在细胞中的含量又是最少的。一个典型哺乳动物细

8、胞约含10-5mgRNA ，其中80-85% 为 rRNA（ 28S,18S 和 5S 三种 rRNA），其余 15 20% 主要由各种类型的低分子量RNA 组成（如 tRNA ，核内小分子 RNA 等）。 mRNA为总 RNA的 1 5% 。同时由于 mRNA 是单链的，容易受到核酸酶的攻击，导致在RNA 的操作过程中易于遭遇降解的厄运。 因此，对 RNA 的操作要求比 DNA 的操作更严格， 操作时必须设置专门的处理方法和程序。一、注意事项-控制潜在的 RNA 酶的活性1用具和溶液的去RNA 酶处理用 0.1% 焦碳酸二乙酯 （ DEPC）处理过的水浸泡后再灭菌， 或购买无 RNA 酶污染

9、的用具。对于电泳用具最好使用专用的，不要用于其它分析，在使用之前用洗涤剂洗涮干净，再用 3%H 2O2 和 0.1% DEPC 处理的水浸泡，清洗干净。2 RNA 酶抑制剂的使用为了进一步防范RNA 降解，一般在RNA 样品和 RNA 反应中加入RNA 酶抑制剂，现在应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘RNase 抑制剂。除此之外，还有氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）和硅藻土（吸附RNase 吸附剂）。二、 RNA 的抽提和纯化1酚 -异硫氢酸胍抽提法TRIZOL 试剂是使用最广泛的抽提总RNA 的专用试剂， 由 Gibco公司根据酚-异硫氢酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氢酸胍

10、组成。对任何生物材料的RNA 提取，首先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入该试剂后，可保持RNA 的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含RNA 的水相；通过异丙醇沉淀，可获得RNA 样品。2硅胶膜纯化法RNeasy 试剂盒是由Qiagen公司设计，其设计思路与DNA 的分离纯化思路相似（见图 8.1 ） ，也就是含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时，核酸吸附在硅胶膜上，从而与其它细胞成分分开，然后在低盐浓度下核酸可从硅胶膜上洗脱出来。三、 mRNA的纯化mRNA的纯化主要是针对真核生物而言的，由于真核生物 mRNA 的poly（ A） 尾，可用亲和

11、层析的方法纯化。 有许多类型的商业化层析柱可用于3'端有一个mRNA 的纯化。四、 RNA 的电泳检测RNA 的浓度和纯度可通过测试其OD260 来判断， OD260 为 1时相当于浓度为mg/ml 。而要直观地观察RNA 的存在以至于分析，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝40胶电泳来完成。1琼脂糖凝胶电泳通过琼脂糖凝胶电泳进行RNA 分析和 DNA 分析的原理是类似的。不同的是， RNA分析是在变性的条件下进行的。常用的变性剂为甲醛， 也可使用氢氧化甲基汞和乙二醛-二甲基亚砜（ DMSO）。2聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小分子量的单链核酸，如小分子量RNA 寡核

12、苷酸、 DNA 序列分析等。其变性条件可用加热方式，或使用尿素等变性剂。第三节蛋白质的SDS-PAGE一、检测蛋白质的分子量（见实验）二、Western blot （见本章第四节）三、蛋白质氨基端序列测定3.1 电泳3.2 转膜PVDF3.3 染色、脱色3.4 干燥、检测第四节分子杂交分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在， 以及其分子量大小。 根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交，以及由此而简化的斑点杂交、 狭线杂交和菌落杂交等。一、 Southern blottin

13、g1转膜当目标 DNA 经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在 0.4N NaOH 碱性条件下变性，再在1.5M NaCl/1M Tris（ pH7.4 ） 条件下中和使DNA 仍保持单链状态。然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过80 处理或紫外线照射将DNA 固定在滤膜上。图4-2 是通过毛细管渗吸法进行 Southern blotting的经典装置图。2分子杂交2.1预杂交将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。

14、2.2杂交在一定的溶液条件和温度下， 将标记的核酸探针与滤膜混合， 如果滤膜上的 DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。2.3洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。3检测3.1放射性标记、检测在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P， 33P和 35S 。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的 位磷酸整合到核酸链中，因此使用 位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如 - 32 PdATP。而在标记 5'末端磷酸基团的反应中一般使用 位磷酸被标记的ATP 。放射性的信号通过 X-光片放射自显影或磷屏扫描获取。3.

15、2非放射性标记、检测。其中应用最成功的是原德国宝灵曼公司开发的地高辛（ digoxygenin,DIG） 标记核酸探针。将 DIG 与 dUTP 交联，在参入核苷酸的标记反应中用DIG-11-dUTP（或DIG-11-UTP）取代 dTTP （或 rTTP ），使探针 DNA 或 RNA 分子被 DIG标记。 DIG 标记的检测是该技术的核心，即利用抗 DIG 的抗体通过酶联免疫反应来完成。将抗 DIG 的抗体与碱性磷酸酶偶联，通过免疫反应将碱性磷酸酶携带到目标核酸分子处，在加入显色剂BCIP/NBT（5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚磷酸盐 / 盐酸氮蓝四唑）后碱性磷酸酶与显色剂反应形成浓紫

16、色偏棕色沉淀，从而显示出目标分子的有无和位置。图4-3是通过地高辛标记探针的Southern杂交实例。M，地高辛 （ DIG）标记的分子量标准（ lDNA/ Hin d）； 1-3 ，苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株的总 DNA 分别经Kpn Pst 、 Pst 和Kpn 酶切。以cry1Aa 杀虫晶体蛋白基因中的 728bp片段作探针，通过随机引物标记的方式，用DIG 标记探针。结果显示，该菌株至少含有两个杀虫晶体蛋白基因，而且其拷贝数明显不同。预示至少其中一个基因位于多拷贝的质粒上。图 4-3：通过地高辛标记探针的Southern通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源

17、的其分子量。 Southern杂交主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，在的限制性酶切片段的大小。应用该技术的前提是必须要有探针。4探针的标记杂交结果DNA 分子及以及该基因所在一个核酸样品中查找是否存在某一特定序列的分子可用分子杂交来检测，但首先要有一段与目标核酸分子的序列同源的核酸片段。将该片段标记后与样品核酸进行分子杂交，通过检测标记核酸的存在从而判断样品中特定核酸片段的存在。 用作检测的核酸片段即为探针 （ probe ） 。4.1均匀标记间接标记不是标记探针分子本身， 而是复制一段新的探针分子， 在复制过程中掺入标记的核苷酸（如 - 32 PdATP ），从而使整个新分子被均匀

18、地标记。切口平移标记这种标记方式目前只有通过大肠杆菌DNA 聚合酶 来完成，只有该酶具有5'-3'外切活性。 通过在待标记的DNA 分子上产生切口，该酶引发5'-3'外切反应， 在随后的 5'-3'DNA 聚合反应中若存在标记的脱氧三磷酸核苷酸（ dNTP），新合成的核酸链就带有标记物。在整个标记反应体系中，待标记的DNA 分子的任何一条链中的任何位点（除靠近 5'端外）都可能作为标记反应的起始点，并持续到该链的3'末端。 因此， 新合成的被标记的分子可以代表该待标记的DNA 分子的绝大部分核苷酸序列。随机引物标记利用由 6个核苷

19、酸组成的序列随机的寡核苷酸为引物，在Klenow酶的作用下对目标 DNA 进行随机扩增。 这样扩增出来的DNA 产物包括从任意某个位点（可能最靠近5'的一些核苷酸除外）起始的单链DNA 片段，其整体应该包含了目标DNA 所有核苷酸序列信息。在扩增中加入标记的dNTP ，扩增出来的DNA 产物就可用作探针。该方法多用来标记一个 DNA 片段。PCR 扩增标记在 PCR扩增时加入标记的 dNTP ，不仅能对探针 DNA 进行标记还可进行大量扩增，尤其适合于探针 DNA 浓度很低的情形。4.2单链探针单链 DNA 探针单链 DNA 探针是通过单链模板来制备的。首先将待标记的双链DNA 连接到

20、 M13噬菌体载体或噬菌粒载体上，制备其单链DNA ,然后以单链DNA 为模板，以对应于载体上插入位点两端序列之一的通用引物为引物，在有标记的dNTP 存在下，通过Klenow DNA 聚合酶合成单链DNA 。经过分离纯化后即可得到高质量的带标记的单链DNA 探针。单链 RNA 探针在有些质粒载体的多克隆位点两端带有噬菌体的启动子，例如pGEM-3 和pBluescript 系列载体分别含有T7/SP6噬菌体启动子和T7/T3噬菌体启动子。 将待标记的 DNA 片段插入载体的多克隆位点，在转录区下游选择一个酶切位点，用限制性内切酶将载体线性化以防止转录出载体的序列和多联体产物。加入对应的噬菌体

21、RNA 聚合酶，rNTP 和某个标记的rNTP在体外进行转录，合成出标记的单链RNA 。利用无 RNA 酶活性的 DNA 酶处理以及后续纯化步骤可获得纯化的单链RNA 探针。单链RNA 探针的制备不仅比单链 DNA 探针更容易，而且其产生的杂交信号更强。4.3末端标记直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子， 或直接在探针分子上加入标记的原子或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进行标记，亦称末端标。DNA 片段的末端标记末端标记主要通过酶促反应来完成，但标记的方式很多。如Klenow DNA 聚合酶和T4 或 T7 DNA 聚合酶在对DNA 片段进行末端补平反应或平末端的置换反应

22、时可引入标记的核苷酸，T4多核苷酸激酶可在DNA 的 5'末端引入标记的磷酸基团或将5'末端的磷酸基团用标记的磷酸基团置换，末端转移酶可在DNA 的 3'末端连接标记的核苷酸。寡核苷酸的标记合成的寡核苷酸主要通过记，也可利用末端转移酶在3'T4 多核苷酸激酶在末端连接标记的核苷酸。5'末端引入标记的磷酸基团进行标二、原位杂交原位杂交就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA 释放出来，并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA 。菌落杂交主要用来从用质粒或

23、Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆子，当得到阳性克隆子后，再通过Southern杂交进一步验证。通过这种方法在一张直径为9cm 的滤膜上，可检测成几百到一千甚至上万个菌落，达到高通量筛选的目的。斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将 DNA 或 RNA 分子以斑点的形式固定在滤膜上， 然后进行分子杂交。其杂交的信号比菌落杂交和噬菌斑杂交受到蛋白质等细胞成分的干扰小， 其结果的可靠性更强。 当核酸分子的斑点面积变得更小， 在单位面积滤膜上处理的样品数量就更多，当检测的灵敏度进一步提高后，就发展成 DNA 芯片。四、 Northern blotNorthern转移的是RNA 而不是个与

24、Southern blotting杂交的总体过程与DNA , 这种将 RNA对应的名称，Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中样品从凝胶转移滤膜的方法，其设计者为之起了一Northern blotting。其后的分子杂交过程与Southern杂交过程中的分子杂交方式是一样的。Northern杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的mRNA 分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。五、 Western blotWestern杂交的总体过程也与Southern杂交相似，只不过在 Blotting过程中转移

25、的是蛋白质而不是DNA ，这种将蛋白质样品从SDS-PAGE 凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为Westernblotting。其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交，而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是 DNA 或 RNA， 而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。Western杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显示出目标蛋白。六、蛋白质

26、N 末端序列测定七、 RNA 端点分析1 RNA 的 S1核酸酶作图对 mRNA的端点进行分析之前必须知道 mRNA 的核苷酸序列， 也就是必须获得该基因的核苷酸序列。 首先预先判断 mRNA 的端点位置， 设计一段覆盖该端点的寡核苷酸， 并作末端放射性标记。 然后将该标记的寡核苷酸与 mRNA 混合， 退火，形成杂交体。 在 S1 核酸酶作用下，呈单链状态的 DNA 和 RNA 被降解，保留 DNA-RNA 杂交体双链，最后通过凝胶电泳检测 DNA-RNA 杂交体中标记的DNA 单链的分子量大小，从而推断mRNA 的末端序列。 其工作原理见图4-4。这种方法既可以分析mRNA 的 5 

27、9;端也可分析3 '端。2引物延伸法分析mRNA 的端点引物延伸（ primerextension）法主要用于mRNA 的 5 ' 末端作图，先要知道该基因的核苷酸序列并预先判断mRNA 的端点位置。首先在mRNA 的预测的5 '末端下游约150bp 位置处， 设计一段互补寡核苷酸引物。以 mRNA 作模板，用反转录酶延伸该引物，生的 cDNA 与 mRNA 模板互补且其长度与引物5 '末端至 mRNA 的 5'末端之间的距离相等。产第五节生物芯片技术一、生物芯片的定义生物芯片（ Biochip ）是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、

28、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、 蛋白质、 基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片 （又称 DNA 芯片）是生物芯片的一种类型，它是将 DNA 分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中mRNA 的表达量， 也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具。二、基因芯片技术的发展史1989 年英国牛津大学的Southern等取得了在刚性载体表面固定寡聚核苷酸及杂交

29、法测序的专利； 与此同时俄罗斯和美国的科学家也提出了运用杂交法测定核酸序列（SBH）的设想。 1994年研制出了一种基因芯片并用于检测 - 地中海贫血病的基因突变，筛选了一百多个 - 地中海贫血病已知的突变基因。1995年，一些国际大公司与研究机构合作共同开发具有商业价值的生物芯片及其相关的分析技术。1997年世界上第一张全基因组基因芯片含有6116个基因的酵母全基因组芯片在斯坦福大学Brown实验室完成。从而使基因芯片技术在世界上快速得到应用。三、基因芯片技术的特点基因芯片技术的特点的核心是微型化。芯片每平方厘米固体表面上可固定十万个DNA 片段、数万个基因。 一次分析可得到数万个基因的表达

30、信息。 微型化的另一方面是样品用量与试剂用量的微量化， 用纳克级的 mRNA 、微升级的杂交液就能分析成千上万个基因的表达信息。这些都是其它研究技术所无法比拟的。芯片制作及分析过程易于自动化。 芯片设计制作可实现自动化， 可根据要求将需要分析的基因制作成符合要求的芯片； 杂交、洗片等过程都可实现自动化， 工作效率大幅提高。四、生物芯片的分类1按载体材料按载体材料可将芯片分为玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。目前，玻片材料因易得、荧光背景低、 应用方便等优点在国际上被广泛接受。通常是将玻片用化学方法处理并联接上活性基团，如氨基、醛基、巯基等，使生物分子通过共价键或离子键与载体结合。2按点样方式根据芯片

31、点样方式不同，可分为原位合成芯片、微矩阵芯片和电定位芯片三类。 原位合成芯片（Loci-synthetic DNA Chip） 矩阵芯片（ Microarray） 电定位芯片（Microelectronic）3按芯片固定的生物分子类型根据芯片固定的生物分子类型可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室。 基因芯片或DNA 芯片 蛋白质芯片（Protein Chip） 芯片实验室（Lab-on-Chip ）4按芯片使用功能分类生物芯片因功能和用途不同可分为测序芯片、表达谱芯片和基因差异表达分析芯片等。 测序芯片 表达谱芯片 基因差异表达分析芯片五、基因芯片的制作1 DNA 样品的来源2

32、生物芯片的制作生物芯片微阵列的制作技术按照制作方法可分为两大类，即原位合成和预合成后点样。预合成后点样是指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经合成好，点滴系统需要做的就是把这些合成好的样品涂印或喷涂在基体上。 原位合成方法则是由点滴系统将探针的组成部分逐步转移到基体上， 同时实现探针合成和转移的目的。 目前已经知道的基因芯片制作法有，接触点样法、喷墨法和原位合成法等。 接触点样法 喷墨法 光刻 DNA 合成法3制作生物芯片常用的工具4 DNA 分子在刚性表面的固定基因芯片技术包括三大部分，即芯片的制作； 样品的标记； 探针与标记样品的分子杂交等。基因芯片制作的关键就是如何将大量的探针分子固定于支

33、持物上，的构像处于自然状态，使探针 DNA 分子能自由地与样品分子进行杂交。并保持探针分子六、基因芯片的杂交及结果分析将不同条件下从某生物体中转录出来的所有mRNA 经标记成为探针后， 再与包含它所有基因而制成的芯片杂交。通过分析杂交位点及其信号强弱，就可得出不同情况下每个基因是否已表达及表达多少。1探针的标记标记的方法通常是在反转录的底物中加入带有标记基团的寡核苷酸单体，通过反转录将标记分子掺入cDNA 分子中。mRNA 反转录标记方法直接影响DNA 芯片分析结果的准确性及重现性。2杂交在一定的条件下， 分子间氢键的断裂与恢复是结合的根本动力，这一过程称之为杂交。DNA/DNA 、 DNA/

34、RNA 分子间选择性3芯片结果读取与扫描仪4生物芯片的软件系统与数据处理七、基因芯片的应用1基因表达分析；2基因型及多态性分析；3杂交测序；4核酸和蛋白质相互作用的研究；5疾病的诊断与治疗；6药物开发；7在营养与食品卫生领域的应用；8在环境科学领域中的应用。第六节RNAi技术一、什么是RNAiRNA 干扰（ RNAinterference ，RNAi）是由双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子在 mRNA 水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。 dsRNA 可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达， 用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。 因此， RN

35、Ai 技术又被形象地称为基因敲低（ knock-down ）或基因沉默（ gene silencing ）。 RNAi 是一种典型的转录后基因调控方法， 又称转录后基因沉默 （ post-transcriptional gene silencing ，PTGS）。 RNAi 现象广泛存在于生物界中。它在真菌中被称为 quelling ，在拟南芥、烟草等植物中被称为 PTGS 或共抑制（ co suppression ），在无脊椎动物如果蝇、水螅、线虫以及脊椎动物斑马鱼、 小鼠等动物界中被称为 RNAi 。 PTGS 物等普遍存在的一种古老、保守而又极其重要的遗传行为。可能是生物界， 包括植物和

36、动二、 RNAi 的发现1995 年， Guo 等把 par-1基因的反义RNA 注射进秀丽新小杆线虫性腺的合胞体细胞中后，在受注射的亲本及其子一代的体细胞中，产生了par-1基因功能缺失型或基因敲除型的表型。奇怪的是仅注射par-l基因的正义RNA 链后， par-1基因表达也同样受抑制。1998 年 Fire等证实，在以秀丽新小杆线虫为材料的实验中，强烈而特异的基因表达抑制是由dsRNA 介导产生的。他们发现，纯化后的单链RNA（ single strandedRNA，ssRNA）很难导致基因敲除型的表型。Guo 等的实验中观察到的所谓“ssRNA 导致同源基因沉默”的现象，事实上是由于制

37、备ss-RNA 时混有的微量的互补型ssRNA 所致。由于当时不清楚为何dsRNA 产生此作用， 所以 Fire等将这种由dsRNA 引发的特定基因表达受抑制现象称为RNAi。这是有关生物界存在RNAi现象的首次报道。1999 年， Hunter等的实验进一步验证了RNAi的存在。他们将dsRNA 去除后，再将正义或反义的ssRNA 注入线虫卵中，没有产生基因沉默现象。相反，如果将上述正义及反义 ssRNA 混合，经退火复性后得到的dsRNA 注人线虫卵中可以显著地产生基因沉默现象，从而印证了Fire等提出的 RNAi作用是由 dsRNA 引起的结论。随后， RNAi技术被成功地应用到某些哺乳

38、动物细胞中，展示了此项研究更为广阔的应用前景。三、 RNAi 的作用机制RNAi 发挥作用的过程可分为两个阶段，即起始阶段和效应阶段。在起始阶段，双链 RNA 分子进入细胞后被称为Dicer的核酸酶切割为21-23 个核苷酸长的小分子干扰RNA 片段（ small interfering RNA, siRNA）。 Dicer核酸酶属于RNase 家族，能够特异识别双链 RNA ，产生的小片段 RNA 的 3'端都有 2个突出碱基。 然后双链 siRNA与核酶复合物结合形成 RNA 诱导沉默复合体（ RNA-inducedsilencingcomplex, RISC）。随后进入 RNA

39、干扰效应阶段，即siRNAs打开双链从而激活RISC ，激活的 RISC 通过碱基配对与对应的 mRNA 结合，并在距离 siRNA 3'端 12个碱基的位置切割 mRNA 。同时，siRNA 可作为引物并以 mRNA 为模板合成新的dsRNA 。这样又可进入上述循环，继续对目的 mRNA 进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。 确切切割机制尚不明了，但每个 RISC 都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的核酸酶。四、 RNAi 的特点1 siRNA 的结构和功能之间存在相关性。dsRNA 经过切割形成 20 25nt 的 siRNA ，它们具有 5'末端的磷酸

40、基，3' 末端的羟基和 2个突出的单链核苷酸。这种结构对于 RNAi 是十分必要的。 Nykanen等的研究表明平末端的siRNA 或失去 5'磷酸基团的 siRNA 不具有 RNAi的功能。所以， siRNA 的三大结构特征是： 长度为21 23nt 、双链两端各有两个突出的 3'碱基、 5'端有磷酸基团。这些特征使得 siRNA有别于其它的 dsRNA ，这也是细胞能够区分出真正的siRNA 和其它 dsRNA 的分子基础。基于 RNAi 的这一特性，细胞可以自行监控异常的mRNA ，并封闭该基因的表达。2 RNAi 的特异性。众多实验结果表明： 导入生物体

41、的 siRNA 只能引起同源基因表达的抑制， 而无关基因不受影响。而且，在 siRNA 序列中配对的 19 21nt 中如果只改变一个核苷酸，就可以使该 siRNA 序列不对靶 mRNA 起作用，证明 RNAi 有明显的特异性。科学家可以通过制备外源性的 siRNA 并导入细胞内， 特异性地抑制某些基因的过度表达和抑制突变基因的表达，研究基因的功能。3 RNAi 的高效性。dsRNA 在 DICER 作用下形成 siRNA ，siRNA 解链与 RISC 形成复合物， 这些 RISC 可专一性地与靶向的 mRNA 特异性结合。 siRNA 也有可能不与 RISC 结合，而是通过解链直接靶向结合 mRNA 。根据 RISC 结合位点或单链 siRNA 结合位点在 RdRP 作用下可形成新的 dsRNA ，后者被 DICER 特异识别而将dsRNA 切断，形成新的靶向 mRNA 。切断后的mRNA 或被核酸外切酶所降解，或可能成为异常用下