细胞免疫荧光课稿

1、DAPIDAPI 即 4',6- 二脒基 -2- 苯基吲哚 (4',6-diamidino-2-phenylindole) ，是一种能够与 DNA 强力结合的 荧光染料 ，常用于荧光显微镜观测。因为 DAPI 可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下，DAPI 染剂是利用紫外光波长的光线激发。当 DAPI 与双股 DNA结合时，最大吸收波长为358nm ，最大发射波长为461nm ，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。 DAPI 也可以和RNA 结合，但产生的荧光强度不及与DNA 结合的结果，其发散光的波长范围约在400nm 左右。DAPI

2、的发散光为蓝色，且DAPI 和绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP) 或Texas Red 染剂 (红色荧光染剂 )的发散波长，仅有少部分重叠， 研究员 可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。DAPI 能快速进入活细胞中与 DNA 结合，因此 DAPI 对生物体而言， 也被视为一种 毒性物质与致癌物 。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。染色原理：DAPI为一种 荧光染料 ，可以穿透细胞膜与细胞核 中的双链DNA 结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI 自身强 20多倍的荧光，和 EB 相比 ，对双链DNA 的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到

3、显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记 的效率高 (几乎为100%) 。 DAPI 染色常用于 细胞凋亡 检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪 检测。DAPI 也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA 染色。细胞经热激处理后用 DAPI 染色 3 分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。a、 正常的烟草 细胞核 ：核形完整，染色质均匀。b、染色质 固缩，向外周聚集，形成周边化。c、 染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质 。d、 细胞核破裂形成碎片，核解体。染色步骤 编辑在细胞移植前， 将 DAPI以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用 PBS缓冲液漂洗至少

4、6 次以洗掉未结合的DAPI ，再用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM培养基制成细胞悬液以备用。存储条件：-20 避光保存每次使用，用量较少，可反复冻融，无需分装注意事项：1、 DAPI 强烈致癌，操作时要戴上手套。2、贮存液用 70% 酒精配制，浓度 100 g/ml ，可用黑纸包住， 长期冻存。 使用液按 1:1000用 PBS 稀释，最终浓度 100 ng/ml 。3、 DAPI 是非常优秀的DNA 染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI 染色。FAM( 羧基荧光素 )分子式： C21H12O7分子量： 376.32别名： 5-FAM结构式：5-Carboxyfluorescei

5、n性状：溶于水 ,溶于 DMSO 和 DMF贮存：- 20°C 干燥避光保存用途：5-FAM 主要应用于DNA 自动测序中， 标记其中的d/ddCTP（三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸、 2',3'-双脱氧胞嘧啶三磷酸 ），也经常用于 PCR 产物定量，核酸探针等。FAM 梭基荧光素 (carbox 州 uorescein)是荧光素衍生物的一种 ,其中 5一 FAM(carbox姆 uorescein一 sueeimidvlester),广泛存在于荧光标记试剂盒(Ap- plied Bio叮 stems Co 甲oration,AmpF比声脯 ler Rus 翎 ,PeRA 呷

6、 li6eationKit User 乞 Manual;Prome 罗 Co 甲oratoin,Gene 而 ntTM PowerPlexTM,1.2 System Technic以 Manual) 。 FAM 与氨基反应快速 ,产物 也 更稳 定 , 适 用 于 氢 离 子 激 光 (Argon一 ionl 丑 ser) 的488nm 光 谱线,Abs/Em=492/slsnm(pH=9.0), 具有荧光素衍生物的普遍特性,在水中稳定。FITC （异硫氰酸荧光素）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和

7、酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4 ，最大吸收光波长为490 495nm ，最大发射光波长为520 530nm ，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC 在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。蛋白荧光标记试剂，也是医学诊断药物，主要用作荧光抗体技术中的荧光染料，能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光。用于医学，农学和畜牧等方面，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。5-FITCFITC

8、IsomerI;fluorescein-5-isothiocyanate异硫氰酸荧光素3326-32-7C21H11NO5S389.38用于标记蛋白，2 8°C 保存 50 mgusing ASF (a nuclear speckle marker)核斑纹标记（1）荧光素类Fluorescein标准荧光素（Referencestandard ）之一 , 在其基础上进行结构改造 , 可产生一系列荧光素衍生物。Fluorescein适用于Argon-ionLaser 的 488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。与其他荧光素类衍

9、生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高， pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。主要应用于聚焦激光扫描微阵列（ Confocallaserscanningmicroscopy ）和流式细胞计应用（ Flow cytometry ）。FITC异硫氰酸荧光素， Fluoresceinisothiocyanate，是荧光素衍生物的一种， 5-FITC 较 6-FITC 更经常使用。FITC 的异硫氰酸基能与氨基反应， 可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。 适用于Argon-ionLaser的 488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=9.0）。与蛋白的结合力也强。FI

10、TC 具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。FITC-Oligo广泛用于杂交探针； FITC- 多肽用于 Edman降解蛋白测序； FITC 也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。FAM羧基荧光素， Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。Carboxyfluorescein-5-succimidylester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。与 FITC 相比， FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC 结合蛋白的量更大且进程更易于控制。FAM 也适用于Argon-io

11、nLaser的 488nm 光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。5-FAM主要应用于 DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于 PCR产物定量，核酸探针等。TET四氯荧光素， Tetrachlorofluorescein，是荧光素衍生物的一种。TET以及 HEX均是在 FAM基础上加以改进的，氯原子使 FAM的 Abs与 Em值都产生一定的红移，并在一定程度上减弱了pH 敏感性。也适用于 Argon-ionLaser 激发光源， Abs/Em=521/536nm 。TETTET，HEX，FAM和TAMRA可

12、配合用于DNA自动测序中，其中TET用于标记d/ddATP， HEX 用于标记d/ddGTP或d/ddATP（ PE公司）HEX六氯荧光素，Hexachlorofluorescein，是荧光素衍生物的一种。适用于Argon-ionLaser激发光源，Abs/Em=535/556nm。（请参见TET介绍）JOE羧基-4',5'-二 氯-2',7'-二甲氧基荧光素，Carboxy-4',5'-dichloro-2'，7'-dimethoxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种， 6-JOE更被广泛使用。JOE荧光产量高， pH

13、敏感性弱，适合于标记蛋白。6-JOE 也适合于 Argon-ionLaser 激发光源， Abs/Em=520/548（pH=9.0）常用于 DNA自动测序，标记 d/ddATP，也经常被用于进行电泳检测与 PCR产物定量。（ 2）罗丹明类（ Rhodamine dye）R110标准荧光素（Reference standard ）之一 , 在其基础上进行结构改造 , 即可产生一系列罗丹明类衍生物。 与 Fluorescein 类衍生物相比，罗丹明类荧光素具有更强的光稳定性， 更高的荧光产量以及更低的 pH敏感性罗丹明类荧光素极为适合于标记寡核甘酸， 但蛋白会引起大多数罗丹明类荧光素的荧光淬灭，

14、故大多数不适宜用于标记蛋白。R110被用于 DNA自动测序。TAMRA全称羧基四甲基罗丹明，即Carboxytetramethylrhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，6-TAMRA被广泛使用。TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的，6-TAMRA适用于Argon-ionLaser 激发光源， Abs/Em=547/573nm（Ph=8.0），6-TAMRA（NHS）常用于荧光标记试剂盒中。6-TAMRA主要用于DNA自动测序中。TexasRedTexasRed是一个长波长荧光素, 与Fluorescein几乎没有波谱重叠 ,只适合于Ar-KrLaser的 568nm光谱线或He-NeLa

15、ser的 594光谱线 , 比 Tetramethylrhodamine和 LissamineTMRhodamineB波长更长，荧光量更高。TexasRed 在荧光微阵列和流式细胞计中更被经常作为第三波长标记 (Thirdlabels)。（ 3）BODIPY类BODIPY类荧光素是由分子探针公司开发，以用来替代那些有部分缺陷的传统荧光素，普遍具有荧光产量高，pH 敏感性低（无离子变化），光稳定性强以及发射波谱窄的优点，故 BODIPY类荧光素已被广泛用于核酸，脂肪酸，磷脂以及各种受体。同时，由于在电泳过程中对序列片段影响小，故已被逐渐用于DNA自动测序。但相对而言,BODIPY类荧光素并不特别

16、适合标记蛋白.BODIPY FL 可代替FluoresceinBODIPY R6G可代替 Rhodamine6GBODIPY TMR可代替TetramethylrhodamineBODIPY TR 可代替TexasRed这些 BODIPY类荧光素具有与被替代物几乎类似的光谱特征，能共用同样的光过滤器与激发光源，但更具优点。（4）其他荧光素CascadeblueCascadeblue是在芘(pyrene)结构基础上改造得来的, 即sulfonatedpyrene,它是一种短波长紫外激发荧光素, 与另一种常用的紫外荧光素Aminocoumarin相比,Cascadeblue的Em 与Fluoresce