血清脂类测定

1、血清脂类测定血浆中的脂类包括胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。目前，对有关脂类代谢疾患的诊断和治疗过程，均必须检测血浆（清）中的脂类，通过其含量的变化，对临床疾患提供协助诊断的依据。有关医学科研工作，脂类的定量检测也是一项必备的研究项目。1胆固醇测定血浆中胆固醇及其酯的含量检测，从方法学上可分为两大类：一类是化学法包括抽提法和直接测定法，这类方法目前仍在沿用；另一类是酶法测定，方法敏感特异快速，并能自动化分析，已常规应用。化学测定法种类多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定的差异。目前公认的参考方法是Abell-Kendall(L-B反应)法。另外，三氯化铁-硫酸反应法（Z

2、ak法）具有显色稳定法、操作简便、灵敏度约5倍于L-B反应法，胆固醇酯与游离胆固醇显色程度比较接近等优点，缺点是特异性差，干扰因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血清样品中的血红蛋白，胆红素以及硫酸的质量等因素均可影响Zak方法的准确性，Zak法更适合于科研使用。酶法测定血清胆固醇的方法已被广泛采用，国产试剂已能满足临床的需要。胆固醇测定用的标准品，按美国国家标准局（NBS）出品纯度达99.8%,是国际公认的参考物，国内李健斋等已纯化制成符合这一要求的胆固醇纯品，已供临床检测血清胆固醇使用。2甘油三酯测定血浆甘油三酯的测定，目前多以化学法和酶法定量。化学法测定甘油三酯是以脂蛋白变性，水解

3、成甘油，并以甘油为计算依据。酶法是以特异酶水解甘油三酯，除去脂肪酸，再测定甘油，方法特异，准确而快速，临床广为应用。目前甘油三酯测定的方法主要以定量甘油为依据，然而血清样品中存在有游离甘油，如何从反应过程中的总甘油中减去游离甘油，多年来一直在研究讨论这一问题。若不减去，其测定值将会高于血清样品中的真值，如果要减去，就必须先测出血清样品中的游离甘油，甘油三酯的测定方法将增加一个繁杂的步骤，实际工作中难以做到。有报道血清样品中的游离甘油实际量是0.070.13mmol/L，相当于甘油三酯的0.56.0mmol/L，为此建议，实测的甘油三酯量减去一个校正系数即：甘油三酯（mmol/L）=0.98&#

4、215;总甘油（mmol/L）-0.07（mmol/L）。这一校正系数也仅适用于健康人，对临床病人并不一定适用。据报道，血清样品的游离甘油一直是个未知数，无法测准。为此，目前临床测定血清甘油三酯时，基本上未考虑游离甘油，因为其含量很少，暂且忽略不记。甘油三酯测定的参考物，推荐三油酸甘油酯和三软脂酸甘油酯混合物（2：1，W/W），此参考物适用于化学法。在酶法测定中，仍以高纯度的三油酸甘油酯为参考物。3磷脂测定血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂、脑磷脂和其他少量磷脂。如需要分别检测各种磷脂，可以通过薄层层析法、柱层析法和高压液相色谱法。目前，临床仅测定血清磷脂总量。血清磷脂总量的测定方法有化

5、学方法和酶法两大类。化学法是以磷脂中的磷为定量依据，因为每磷脂分子中都含有一个磷酸根，故将磷脂的磷称为脂性磷。由于血清中磷脂大部分为卵磷脂，其分子量中磷约占4%，故将脂性磷换算成磷脂的系数，一般为25。由于化学法均需要抽提，再测抽提液中的磷脂的磷，血清中的磷酸盐不可能混入抽提液中，因此血清中的磷酸盐对磷脂测定的干扰很少。酶法是利用磷脂酶进行定量测定。生物体中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四种。磷脂酶D特异性差，均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神经磷脂，三者约占血清总磷脂的95%，临床多用含磷脂酶d 的试剂进行磷脂的定量测定。4游离脂肪酸测定游离脂肪酸属于未酯化的一类脂肪酸，故又称为非酯化脂肪酸

6、，其量很少，采用方法必须是灵敏的方法，还需要避免脂肪水解产生脂肪酸的干扰。测定方法有：滴定法需要微量滴定装置，因为要通过肉眼观察颜色，难免会有主观因素的影响，所以难以测定准确，很难用于常规；光度法，以铜皂法常用；酶法，主要采用特异性不强的脂肪酶D进行检测，方法特异，快速准确，已常规应用于临床。第一节胆固醇测定血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸（43%）、油酸（24%）、软脂酸（10%）、亚麻油酸（6%）、花生四烯酸（6%）、硬脂酸（3%）等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最

7、少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。1化学法化学法一般包括：抽提；皂化；毛地黄皂苷沉淀纯化；显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过步骤操作过程。常规操作中多采用省去了、。或者用省去、步骤的Zak-Henly法及省去步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。2酵法测定CE在胆固醇酯酶（cholesterolesterase）作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase,COD）氧化成4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。

8、该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。 一、Abell-Kendall改良法1原理血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。2试剂组成代号种类浓度组成贮存28有效时间R1乙醇优质纯R2石油醚沸点68，特级纯R3水醋酸分析纯R4无水醋酸胆固醇分析用，不含HCIR5浓硫酸分析纯R6KOH液33%(W/W)

9、KOH10g+H2O20mlR7乙醇性KOH液R194ml+R66ml临用前配制R8Liebermann配制后BurchardR420体积+R51体积+R310体积1h试剂*内用完R9胆固醇标准液5.17mmol/L胆固醇标准品200mg+R1100ml0*：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。3操作图15-1 血清胆固醇（Abell法）测定操作图按图15-1操作。4计算标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L) 二、酶法（CEH、COD-POD法）首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶（

10、CEH）水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）作用下，生成4-胆甾烯酮和H2O2，再H2O2经过氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS）参与下，生成红色醌亚胺色素。H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林红色醌亚胺色素（一）手工测定法1试剂组成代号种类浓度组成贮28有效时间Na2HPO450mmol/LNa2H2PO450mmol/L胆酸钠3mmol/L4-氨基安替比林0.82mmol/LR1*ESPAS14mmol/L24hCa

11、rbowax-60000.17mmol/LCEH33U/LCOD117U/LPOD6700U/LR2标准液5.17mmol/L用异丙醇溶解胆固醇*混匀，调pH至6.70±0.10(25)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。2操作按图15-2操作。3计算标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)（二）自动化分析仪测定以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。1试剂组成A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。B液：COD、4-氨基安替比林等。图15-2 血清胆固醇测定（酶法）操作图2上机参数项目参数方法终点法波长双波长（540nm，700nm）反应温度37试剂A

12、反应时间23min试剂B反应时间56min样本用量3l试剂A用量250l试剂B用量120l单位mmol/L3操作过程4计算以A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。5注意事项（1）试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。（2）试剂在有效内28避光食保存。（3）胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。第二节甘油三酯测定甘油三酯又称中性脂肪，由于其甘油骨架上分别结合了3分子脂肪酸、2分子脂肪酸或1分子脂肪酸，相应称为甘油三酯（TG）、甘油二酯（DG）和甘油一酯（MG）。血清中90%95%是TG，TG中结合的脂肪酸分别为油酸（44%）、软脂酸（26%）、亚油酸（16

13、%）和棕榈油酸（7%）。血清TG测定方法一般分为物理化学法、化学法及酶法三大类。血清中TG的化学组成并不单一，准确求其分子较为困难。因标准不同，测定结果存在差异。化学法多采用三棕榈精（软脂精）（分子量807.3）、三油精（分子量895.4）为标准，按摩尔浓度计算。酶法测定以三油精为标准物进行换算。1化学法化学测定法包括：TG的抽提分离；皂化；甘油糖的氧化；氧化生成甲掌显色定量等四个阶段。操作较为繁杂，影响测定因素太多，本法准确性差，一般很少用。2酶法测定酶法测定包括：TG的抽提与皂化；加水分解生成甘油糖定量等二个阶段。目前常规检测应用的方法有甘油激酶（glycerolkinase,GK）法和甘

14、油氧化酶（glycerol Oxidase,GOD）法。操作简便，快速准确，并能在自动化生化分析仪上进行批量测定。 一、乙酰丙酮法1原理血清中加入异丙醇抽提取甘油三酯，经KOH皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸，甘油在过碘酸作用下氧化成甲醛，在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色的3，5二乙酰，1，4二氢甲基吡啶，其颜色的深浅与甘油三酯的含量成正比，420nm测定定量。该法可用于基本功训练及组织细胞TG的提取测定。2试剂组成代号种类浓度组成贮2-8有效时间R1抽提液（CH3）CHOH（A.R）重蒸馏R2吸附剂氧化铝，水洗除去微细颗粒， 110烤干3h以上闭封一周R3皂化剂5%KOH

15、 5g+H2O100mlR4醋酸溶液2mol/LCH3COOH 11.5ml+H2O100mlR5过碘酸钠0.05mol/LNaIO4 1.07g+H2O100mlR6氧化剂R4 1体积+R51体积一周R7醋酸铵液CH3COONH2 15.4g+H2O100mlR8显色剂CH3COCH2COCH30.75ml+R-140ml+R-7 100ml+R-4 80mlR9参考液2mg/dl三油酸甘油酯 2mg+R-1100ml（TG100mg/dl）3操作按图15-3操作。图15-3 血清甘油三酯（乙酯丙酮法）测定操作图4计算血清TG浓度=ESA/EST×1.13(mmol/L) 

16、;二、酶法（GK-GPO-POD比色法）血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成H2O2，H2O2与底物4-氨基安替比林和ESPAS在过氧化物酶（POD）作用下，生成红色亚醌化合物（quinoneimine），比色（500nm），其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。（一）手工测定法1试剂组成代号种类浓度贮存28R1磷酸甘油氧化酶3.0KU/L冷藏（A液）抗坏血酸氧化酶1.0KU/L甘油激酶0.7KU/L4-氨基安替比林80mg/LR2脂蛋白脂酶2.0KU/L冷藏过氧化物酶10KU/

17、LESPAS300mg/LR3（参考液）甘油酸三脂200mg/dl（2.26mmol/L）冷藏*：一般采用商品试剂盒图15-4 血清甘油三酯测定法（酶法）操作图2操作按图15-4操作。3计算血清TG浓度=ESA/EST×2.26(mmol/L)（二）生化分析仪检测全自动生化分析仪测定操作（以CL-7200型为例）。1试剂A液：GK，GPO，4-AA-P、抗坏血酸氧化酶等。B液：POD，Lipase,ESPAS等。标准液：甘油三油酸酯 200mg/dl(2.26mmol/L)。2上机参数名称参数方法终点法波长双波长（540nm 700nm）试剂A反应时间23min试剂B反应时间56mi

18、n反应温度37样本用量4l试剂A用量200l试剂B用量100l单位mmol/L3操作过程4计算以A=A2-A1并根据同样之标准或质控物计算，自动打印结果。5注意事项试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。试剂在有效期内28避光保存。样本中甘油三酯含量超过11mmol/L需用生理盐水稀释后再测。第三节磷脂测定磷脂（PL）并非单一的化合物，其分子内含有磷酸基的多种脂质，磷脂是这一类物质的总称。血中PL包括：卵磷脂占60%和溶血卵磷脂占2%10%；磷脂酰乙醇胺等，占2%；鞘磷脂，占20%。血清PL定量方法包括测定无机磷的化学法和酶法两大类。1化学测定法过程包括：抽提分离；灰化；显色、比色的三个阶段。

19、2酶测定法可分别利用磷脂酶A、B、C、D等4种酶作用，加水分解，测定其产物，对PL进行定量。一般多采用磷脂酶D（PL-D）进行定量。PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及含胆碱的磷脂，这三种磷脂约占血清总磷脂的95%。本法快速准确，便于自动生化分析仪器进行批量检测。 一、化学法（消化法）1原理以有机混合试剂（无水乙醇、乙醇）抽提血清中磷脂，再用浓硫酸和过氯酸消化抽提液中的脂类和其他有机化合物，用硝酸盐与磷反应生成有色化合物，比色定量。本法可用组织细胞磷脂的抽提定量。2试剂组成代号种类浓度组成贮28有效时间R-1抽提液无水乙醇：乙醇=3:1R-2消化液用1L密器，加水约50

20、0ml，置冷水中缓缓加浓硫酸280ml到水中，冷却后加过氯酸（70%，AR）65ml，混匀，加蒸馏水至1000mlR-3显色剂钼酸铵（A.R）2.5g+无水醋酸钠8.2g，加蒸馏水溶解并稀释至1L，监用时取此液体9份加新配的VitC液（10%）1份，混合即可R-4参考液（贮存液）1mg/L称干燥KH2PO（A.R）0.4393g,溶于蒸馏水中，转移至100ml的容量中，用蒸馏水加至刻度。冷藏R-5参考应用液0.04mg/ml取贮存液2ml加至50ml容量中，加水至刻度冷藏3操作按图15-5操作。4计算血清脂性磷浓度=ESA/EST×10(mg/dl)血清磷脂（以卵磷脂计）=ESA/E

21、ST×10×0.3229(mmol/L)图15-5 血清磷脂测定（消化法）操作图*采用带塞玻璃试管 二、酶法1原理磷脂酶D因特异性不高，能水解血清中卵磷脂，溶血卵磷脂和神经磷脂（三者占血清总磷脂的95%），释放出胆碱，胆碱在胆碱氧化酶作用下生成甜菜碱和H2O2，在过氧化物酶作用下，H2O2，4-氨基安替比林、酚发生反应生成红色醌亚胺化合物，其颜色深浅与这三种磷脂的含量成正比，在500nm波长下比色计算结果为：2试剂（1）酶应用液（参考配方）：每100mlTris-His缓冲液（50mmol/L，pH7.8）中含：磷脂酶D45U胆碱氧化酶100U过氧化物酶220U4

22、-氨基安替比林12mg酚20mgCaCl2·2H2O8mgTritonX-1000.2g(2)标准液：纯卵磷脂，临用前配制，5mg/2.5ml蒸馏水（含TritonX-1000.5%）3操作（1）标本采集：空腹12h抽静脉血，不抗凝，分离血清或抗凝血分离血浆。（2）在3.0ml酶应用液中加入血清（浆）20l，标准管加标准液20l，空白管加水20l，放置37水浴10min后，波长500nm，比色，空白管液调零。4计算血清磷脂（mg/dl）=TA/SA×200血清磷脂（mmol/L）=血清磷脂（mg/dl）×0.01292第四节非酯化脂肪酸测定临床上将C10以上的脂肪

23、酸称为游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）或非酯化脂肪酸（nonesterifiedfatty acid,NFFA），正常血清中含有油酸（18:1,W9）占54%，软脂酸（16：0）占34%，硬脂酸（18：0）占6%，是其主要的NFFA。另外还有月桂酸（12：0）、肉豆蔻酸（14：0）和花生四烯酸（20：4，W6，9，12，15）等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平极易受脂代谢，糖代谢和内分泌机能等因素影响，血中NFFA半寿期为12min，极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输，属于一种极简单的脂蛋白。测定血清NFFA法有滴定法。比色法，

24、原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。1非酶法测定非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。2酶测定法主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A（CoA）进行定量。酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。测定原理如图15-6所示。图15-6 血清主要FFA酶法测定图：内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶；PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脱氢酶。 一、亮度法1原理血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。2试剂组成代号种类浓度组