凝胶成像及Quantity-One中文操作说明

1、第一章简介凝胶电泳是每个做分子生物学的研究者天天都耍打交道的根本技术。电泳之后的信息处理与电泳本身同样重要。目前有大量软件可以用于分析电泳结果，要向大家介绍的是 Bio-Rad公司的1D凝胶分析软件Quantity One ( Bio-Rad还有一个做2D凝胶分析的软件PDQuest)。Quantity One软件是常用1D凝胶分 析软件中功能最强大，自动化程度最高的软件。这个软件的最新版本可以在Bio-Rad的网()免费下载，以供试用或用户升级之用。Quantity One软件的主要功能包括定量分析 (Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis) 差显

2、分析(Differential Display Analysis)，克隆计数(Colony Counting Analysis) 等，此外，还可以直接控制Bio-Rad公司的各类图像仪和 ExQuest自动切胶仪，使您的凝胶分析工作变得极为轻松。Quantity One 软件拥有与windows操作系统下绝大多数应用软件相同的友好界面。til* &da Jfi« la«4t Liaifudi Vii»» AhAjriM 備骑计加如血Mtil簞血t fkiie Qai山仏血 tnptjng Qwivk 4uid«fimdk GnitI f

3、it&d. iaedjrin Qiicfc 施J 血 C»l«ny Cwtic ck 缸皿心乳桃致Qoj EID SS?r!匚 Critenor. HE iButeJUdi CMIfMi t*d IultiEtyVvvd Ltnrijrlapjntlic Jrtt仇Mt托H 弟idsTrWSlWfr2 ZixMiB&xDafftrinud Oi fiitdi fm-dlikuiAti tf 4m|t(ilttr89VqimeRed Twt VAmerieelHnj lodVflMncCcntfti T«l 占如t TooT'CjWSfl 1

4、«1网凶1；V -ckk com a mT tan M2 Mb s Me&k插入密码狗，翻开 Quantity One软件，可以看到最上缘蓝色横条幅是标题栏，往下依次是菜单栏和 工具栏。File图像翻开、保存、引入、打印Ma分子量估算、条带匹配分析等操作tchEdit图像普通编辑操作Vo定量分析lumnView图像缩放、三维视图、看光密An浓度估算、克隆计数等分析Imag图像旋转、翻转、裁切等操作Re分析结果输岀portsLane泳道分析Wi窗口分析ndowBand条带分析He帮助、快捷菜单、软件注册Ip等每个菜单的主要功能如下：往下一行是工具栏，上面每个按钮的功能见下表:翻

5、开立fk图像显示控制存条带分析工具*J保存操作界c显示条带！匹配工具a打申图像、L去除分析标记“轮處修改工具,cP看余图卩圈像工具打印快捷指南J局部放大护电文字工舟|定量分析快捶指南日拖处am> p定量工具八条带分析快捶指南门放大并居中HU I1 *灰度分析工斗克隆计数快捶指南户缩小并居中护rmrnw *泳道分析工具誤Quantity One 软件Help aQuick Guide快捷指南提示如何实现一个功能，如定量分析(Volumes QuickGuide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析(Differential Display Analysis)，克隆计数(C

6、olony Counting Analysis) 等。快捷指南下有1，2，3步骤，根据提示完成。使用Quantity One软件进行电泳结果分析，通常包括图像获取、图像预处理、分析、结果输出四部分。图像获取就是通过软件控制扫描仪(GS-800 PharosFX等)或凝胶成像系统(GelDoc、ChemiDoc. VersaDoc等)，图像预处理就是将扫描或拍照获得的原始图像进行初步处理，以便更好地进行后续分析。接下来是分析过程，根据分析的方法和目的不同，又可以分为定量分析、条带分析、克隆计数、差异(聚类)分析 等等。不管如何分析，最终我们都必须通过软件的输岀功能，得到我们想要的结果。Quant

7、ity One软件提供了多种结果输岀方式。在接下来的几章里，我们将按照这个思路，一步步引导您使用这一软件Acquire ImejeOpting ;e Umag普Lane and Bard Analysis ;o ume Analysis Colony CotntngRepot ResultsRg. 1-2 Quantity One workflow第二章图像获取Quantity One 4.4 4.6版本可以控制 Bio-Rad目前几乎所有的图像仪，如GelDoc XR ChemiDocXRS等。这些图像仪采集到的图像，可以直接保存成软件可直接分析的图像，即扩展名1sc的原始图像文件。下面将具

8、体介绍如何通过 Quantity One 软件从GelDoc XR获取图像。GelDoc XR是Bio-Rad凝胶成像系统中最常用，操作最简便的仪器，它可以用来拍摄EB SYBFGreen等染料染的核酸电泳凝胶；Sypro Ruby、银染、考马斯亮蓝等方法染的蛋白电泳凝胶；以及化学显色的印记膜等。使用GelDoc XR之前，先接通电源，翻开位于仪器反面右下角的电源开关；然后根据具体的应用选 择适宜的照明和滤光片位置。原那么如下：表格形式模式1.如果样品是通过EB SYBR Green Sypro Ruby等染料通过紫外激发来显色，就先将样品置于紫外 透射平台(UV Transilluminat

9、or)的中间，关上暗箱门，然后按下面板上的“Trans UV按钮，并将滤光片选择杆置于位置“ I 处。模式2.如果样品是通过金属银、考马斯亮蓝等染料染色，就先将白光转换屏(White Light ConversionScreen)取下，翻开下部的开关，放在紫外透射平台上，样品置于白光转换屏中间。关上暗箱门，然后按下 面板上的“ Trans White "按钮，并将滤光片选择杆置于位置“I 处。模式3.如果是化学显色等非透明可见样品，那么用模式2中所示方法，将样品置于白光转换屏中间。关上暗箱门，然后按下面板上的“ Epi White按钮，并将滤光片选择杆置于位置“O处。接下来翻开Qua

10、ntity One 软件，选择File?GelDoc XR，按以下顺序操作:口抵欝农氐1 0*亡 Qomt. it> One ft. 0 (Uiuicll:Lt 411 tiE 址5 Lttv >Uix9 |ktL YgliaM iJlilxiiiLfrd«n Rilpzuaw racusCUV pWhle切母i Aewic6鋼o豁|iBpiv 0mETUi®iw.±1U萌 gm 1 voMwla&0u-=五 o ID qi: (Si bu 1 at i onlQH4HdgK *54ta4Hl PM QfcwOBpiflf 按下Live/Foc

11、us，成像仪进入实时成像； 选择照明模式，一般核酸胶用UV,蛋白胶用 White模式； 注意，选择完成后，要按下成像仪面板上相应的光源按钮 此功能有三个上下键按钮：IRIS 光圈，ZOOM缩放，FOCUS聚焦，您可在软件上直接 调节或在仪器面板上手工调节调节步骤：a调大IRIS，以看到图像b点ZOOM备胶适当放大c调节IRIS至适宜大小一般情况下尽量选择小光圈，因为小光圈景深大，图像更清晰d调节FOCUS至图像最清晰按 按“ Auto Expose ；如是，单击 Auto Expose,系统将自动选择曝光时间成像，如不满意，单击ManualExpose，并输入曝光时间秒，图像满意后保存，在自动

12、曝光期间，图象会持续的输入到CCD中，直到达到一定比例的饱和象素值，此比例在Options dialog box 中设定默认值=0.15 %。AlxcClick on Autobutton aopers depessrc：Sxi III A.xpi« Inmj*rffcivartdEnriiue Tini h »1Car see 于pou ne _ime iiTLomaticaily changingO Frsuef kpMlf# 1 FT* (SM)SfeOl I AtUUntsI laJtfJ_±C ick cc Freeze to stop te eitpo

13、sLire processFig. &*6. Freezing trie exposure.一旦图象质量到达要求，点击Freeze button 来终止曝光。 如是蛋白凝胶，接第 6步直接将清晰的图像保存即可 按下“ Analyze ；这将会翻开一个新的窗口来显示捕获的图象，该图象具有默认名称，具有日 期、时间及用户名如果的话等信息。按下“ Save键，保存图像。第三章图像分析Quantity One的图像分析功能相当强大，根据不同的需要，可以分为定量分析、条带分析、相似性 分析以及克隆计数用于蓝白斑筛选等等，而且每种分析法都有独特的优点和输岀方式。本章重点介绍常 用的定量分析和条带分

14、析方法，其余更细更深的功能请参考软件自带的用户手册。一.定量分析 Volumn Analysis 定量分析是计算选定区域内信号强度的总和，是Quantity One最方便的定量工具。这种分析方式考虑选定区域的真实形状，可用于电泳条带、斑点、大型芯片等图像的定量。这种定量的方法可以扣除背景， 可以按照用户的标准曲线计算岀条带或斑点的浓度，但它不能计算分子量，也不能进行条带匹配和相似性 分析。Quantity One软件称这类定量的结果为 Volume。Volume =选定区域内所有像素信号强度的总和x像素面积Volume 的单位：int x mrh快捷指南Volumes Quick Guide，

15、能够指导您对任意所选区域进行定量分析，此分析可以报告多种结果，常用的结果是相对浓度和绝对浓度须提供标准品。具体的操作方法如下："：J 3 T rnskicnL''5 Vofc/neFiee htfwi Tool& VofejieCortour Ido)? Ssfect fooJ;'S PrW .''§RewxtCwcfck awwiru IxwShJlsMi nlihfr 4 raluna hat1选择成像系统或翻开已保存的文件软件可以控制Bio-Rad所有的成像系统如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-8

16、00,FX,如不是Bio-Rad成像系统所摄取的图象，将图象保存为Tiff 1文件格式，软件也可进行分析处理2. Zoom Box，缩放，对图象进行放大观察3. Transform转化，调节图象的比照度黑白4. 选择待分析区域：Volumn Contour Tool等高线勾勒区域，自动连接浓度相同的点，如U1Volume Free hand Tool自由画笔选择区域，可以勾勒出无规那么形状，如U2Volume Rect Tool矩形区域选择，如 U3Volumn Circle Tool圆形选择区域，如 U4按上面4种方法选择需要定量的区域。5. 双击所选区域，岀现如下窗口，定义样品类型，如未知

17、样品景BackgroundB1,B2，软件在算浓度时会将此区域的浓度自动扣除 如果该样品是浓度标准样品，即定量标准，需在浓度concentrationUnkonwnU1,U2即待计算样品，背或标准样品 Standard Std1,Std2,一栏输入该样品的浓度。6. Select Tool 选择不同区域7. Print Image 打印图像8. Volume Analysis Report定量报告结果，翻开出现如下窗口，选择要报告的参数，主要有2个参数 Volume、adj. Vol.( 即 adjusted volume) 和 Concentration 。Volume 为定量值，adj.

18、Vol. 为扣除 背景后的定量值，如有浓度标准样品( Std)，软件可报告Concentration 绝对浓度。参数选好后，按下按 钮“ done。txt文件，按左侧打印按钮，可将报告9. 软件报告如下列图所示：按右侧输岀按钮，可将表格保存成打印岀来二.条带分析(Band Analysis )条带分析是Quantity One最根本的分析工具，它可以自动识别电泳泳道和识别条带，依据泳道的平 均光密度和条带宽度对每个条带进行模式化定量。这种分析方式虽然不如定量分析来得方便，但这样可以 实现非常复杂的电泳分析，满足各种不同的结果需要。这种方式的最大优点在于它可以完全抛弃人为主观 因素而进行全自动定

19、量。用条带分析的方法进行定量的结果叫Trace Quantity ( Trace Qty )，计算方法是：首先软件自动计算条带上每一横排像素的平均光密度和平均光密度分布曲线，然后每个具体条带的定量值是平均光密度曲线的 线下面积的积分，即：Trace Quantity =平均光密度x条带上下边界的距离Trace Quantity的单位：OD*mmruxrLrLTLnruxrLrLTLnLane Sampling AictnSanaHehtLane Sampling AictnLane TraceLane TraceAverage interisityP«akBand Prolile&#

20、169;刘购e pH>el i“t的 $itycro$5 $snpfe width -integrate under curve (o selin« for bard quantitatm (和即对 x mm J.条带分析中的条带定星鯉下面介绍用此功能对泳道内的所有条带进行分子量确定，相对浓度分析述 IldnsfCKITL. Frerns Lanaa.5l Strdch Frame6 Add/diurt Anehcti ? Lin# Bdckotound 0- Detect Band.9lIQ R阴加比*一11 Match12 Pkinl Image.* 勻 Al LantJ

21、Retwl.1翻开已保存的文件(如不是Bio-Rad成像系统所摄取的图象，将图象保存为Tiff 1文件格式,软件也可进行分析处理)2. Zoom Box，缩放，对图象进行放大观察3. Transform转化，调节图象的比照度黑白4. 确定泳道(lane),并对泳道进行各种调整(实际实验中泳道往往不是垂直的而出现各种变形)按下列图所示在软件的工具栏中有一Lane Tool图标，包含有更多泳道编辑工具。Lane T00I+1汙道编辑工具包RsN T«wl %Lu# 1*41 «组匸一二土总匕二上.上±3:&-FFMWLWWt .SiretchFiarieAdW

22、Adfu 科 Aik bn &Re«W4-AnclMartCr«*e LwAdfjti LaceU 论*it LdWRftmfivt LamLane-V/idth .Ln & 4dwvwdPfalLare匚Lihti .- -? M 孑 一 -* 一 ?" « -7 7 - 一 « 7 一 ? « _? - - 丁. - a1!-翕一Fantwe EjndPh* BandV' Vii1. - nljrwLendAlritM?：Afkrf EjndBand TooIp条带编辑工具邑心5. 选择Frame Lane

23、s，输入图像头际泳道(lane)数并确认。此时图像上泳道的位置上会出现一条条 红线，每条红线就代表一根泳道。6. 选择Add/Adjust Anchors，此时泳道红线上会出现一些小圆圈。这些小圆圈称为锚定点(anchor)， 锚定点规定了泳道走向。当泳道不直时，点击岀现弯曲的泳道部位，就可以增加锚定点。鼠标按住锚定点， 可以拖动锚定点，让每根红线始终位于泳道的中间线上。7. Lane Background去除泳道背景。点击该按钮，选择一条适当的泳道点击之，然后在弹岀的对话框中选“ All Lane On "，在“ Rolling Disk Size 中填入适当的数值18. Dete

24、ct Band，检测泳道内的条带，翻开出现如下窗口。通过调节sensitivity 灵敏度可调节检测岀的条带数，调节Lane Width使代表表带的红色横线与条带宽度差不多宽。中间一行人工编辑按钮可以 用来增加/减少条带、调节条带的上、下边界等。翻开工具栏中Band Tool条带编辑工具包可看到更多编辑工具如上图匚 U tlErt Vu-fxi - Pr4ii=«ibv!* .Ri-attawGAiPOneOfW忖曲朗rWarvitg層trffYrirniShodv*:(S'Aw cut广合 circJEm窑airiii*人工编辑按钮 割圜到SemiMly 10.000s r

25、*314 >1 Dm 即 I t.iXiHauFior 4 CM$JfiAHScrv | 1 .OQ创*1±I*J*1+J 创±Jd±创*|Meet?i»Swie s-9. Standard输入分子量标准，软件自带有许多Bio-Rad的分子量标准，如你用的是自己的标准，进入New Standard建立新的分子量标准，软件可以选择标准单位是MW蛋白质还是 BP 核酸等左下列图。在Protein-Standard对话框中输入分子量数值，完成后单击赋值图标右下列图，回到图象文件上单击标准样品的泳道，软件自动将所输的分子量数值和泳道内的条带一一对应。匚 Q

26、ikAti *蕈UtSefeeiUiMsBase Furs- AsceadlngIQCleqtiq Point-AscendingIso«leccEic Folh-t-D电日匚电ndxntjUTaleculaE ITeighc.- AscendingMaraLaliEfd Rt-DtaccndinEdt I HewCarKd|赋值酢： 告诉时盹彩SMviifd ?ba4 珂 I£<wwr/gg r1IWt血血型墨I id找1010. Band Attribute条带属性，在完成第9步以后，软件已自动计算出了其他未知条带的分子量扌丁开band attribute选择要报

27、告的参数，这里我们选择 Molecular Weight分子量红颜色标记，标准分子量为蓝色标记。图象上可以看到所有条带的a ¥ 占 口 r % 4 3" -霑盂 7二？1 _ 忙 r a kD户 41m广1 nd; IhJrtbii厂IINWIe炉35广J &«W广Ji 理严 TfdvO.L*广 0«#1< fw*. 5". f* t4M T *P 舛 r w*hp务 厂fww 广 Dvil jpi r 士rtThpCgrtwJRRp ritaMdMVr r EmtHsM L211. Print Image 打印图象DbWIhMhftl LdIHMI Hmm?1Z1L va 尸mlAM荷12. All Lane Report所有泳道条带结果报告。翻开窗口，选择要报告的参数，如.分子量，如左下列图，软件将报告结果右下列图，在报告的右下脚有一报告输出工具，点击可将报告结果输出成.txt文本格式或输出至剪贴板，可粘贴到 EXCEL WOR等文件下。LtaM 1OaM*1。躺敬1匸帰3声啊口常10.PPrioriWHI WTfJ* Li忖FCwnv-"