胱硫醚β-合酶基因多态性与颈动脉动脉粥样硬化的相关性初步研究

1、胱硫醚-合酶基因多态性与颈动脉粥样硬化的相关性刘方清,张晨青岛大学医学院附属医院神经内科,山东青岛(266003E-mail:century_i36摘要:目的:探讨胱硫醚-合酶基因多态性和颈动脉动脉粥样硬化的相关性。方法应用扩增阻滞突变体系法(ARMS检测238例颈动脉粥样硬化患者和107名健康体检者的胱硫醚-合酶(CBST833C基因多态性,并进行相关分析。结果:轻度狭窄、重度狭窄组C/C+C/T基因型和C基因频率与内中膜厚度(IMT增厚组及对照组比较增高(P<0.05,经校正动脉粥样硬化的其他已知危险因素后,C等位基因仍然使颈动脉狭窄的危险性增加(OR=1.938,P=0.046。稳

2、定性斑块组、易损斑块组和对照组三组之间C/C+C/T基因型和C基因频率无明显差异。结论:胱硫醚-合酶基因T833C突变与颈动脉粥样硬化狭窄程度相关,而与粥样硬化斑块稳定性无关,CBST833C基因突变是颈动脉粥样硬化形成的危险因子。关键词:胱硫醚-合成酶,基因多态性,颈动脉粥样硬化中图号: R743.3颈动脉粥样硬化是缺血性脑血管病的重要发病原因之一。国外研究报道, 缺血性脑卒中患者30% 由颈动脉病变引起, 且与狭窄处粥样斑块的稳定性有关 1 。研究表明, 高同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy血症是动脉粥样硬化的独立危险因素。胱硫醚-合酶(Cystathio-nine - syn

3、thase,CBS是同型半胱氨酸代谢过程中的关键酶,其基因缺陷影响血浆总同型半胱氨酸水平,间接导致脑梗死的作用。迄今,CBS基因多态性与颈动脉粥样硬化之间的关系国内外尚鲜见报道。鉴于此,我们对CBST833C基因多态性与颈动脉粥样硬化之间的关系进行了初步探讨,先将结果报告如下1. 对象与方法1.1对象及分组病例组共238例,均为2005年8月-2006年8月期间青岛大学医学院附属医院神经内科住院患者。根据超声检查按颈动脉狭窄程度分为以下3组:重度狭窄39例,其中男26例,女13例,年龄4575岁,平均62±7.9岁;轻度狭窄组95例,其中男58例,女37例,年龄4875岁,平均62.

4、5±7.8岁; IMT增厚组104例,其中男63例,女41例,年龄4573岁,平均61.9±7.8岁。颈动脉狭窄两组检出斑块形成患者114例,按照斑块性质分为稳定斑块组和易损斑块组。稳定斑块组73例,其中男41例,女32,年龄4775岁,平均62.7±7.9岁;易损斑块组41例,其中男28例,女13例,年龄4975岁,平均62.6±8.1岁。对照组为同期门诊健康查体者,共107例,其中男74例,女33例,年龄4575岁,平均63.2±8岁。各组性别、年龄差异无统计学意义。1.2 研究方法1.2.1 标本采集及DNA提取所有入选病人均禁食12小时

5、后,抽清晨空腹血4ml,2ml(EDTA抗凝使用小量血液基因DNA提抽试剂盒(上海华舜生物工程有限公司生产提取DNA,2ml血测定血脂、血糖等生化指标。1.2.2 CBS 基因多态性检测应用扩增阻滞突变体系法( amplification ref ractory mutation system ,ARMS 特异性扩增CBS 第833 位核苷酸的DNA 片段,引物参照文献2 设计, 由上海生物工程公司合成:上游引物5- GGAGAAGTGTCCTGGATGCA - 3下游引物野生型5- CCCTTCGGGATCCACCCCAA - 3; 突变型5- CCCTTCGGGATCCACCCCAG- 3

6、。PCR试剂盒由宝生物工程(大连有限公司生产,反应体系25µL,扩增CBS 基因的反应条件为:94 变性5 min ,94 1 循环30 次,72 延伸10 min。2 %琼脂糖凝胶电泳检查PCR 扩增min ,64 1 min ,72 1 min ,产物,扩增目的片段大小为870 bp 。见图1 图1 PCR扩增产物1、2,5、6为T/T型,3、4为T/C型,7、8,9、10为C/C型1.3 颈动脉超声检查对所有入选者记录颈动脉内膜中层厚度( IMT ,有无粥样硬化斑块及其部位、大小、回声和表面特征,有无管腔狭窄及其程度。判别标准: 在纵断面进行测量, IMT1.1 mm为正常,

7、1.0 1.2 mm之间为增厚,内膜中层局限性增厚1.2 mm视为粥样硬化斑块。根据内部回声和表面形态,将斑块分为二型: 稳定性斑块:其表面平滑、内膜完整,且内部为强回声或均匀中等回声。易损斑块:其表面不光滑、内膜不完整,或内部回声不均匀,或内部为低到无回声。采用管腔内径法判断颈动脉狭窄程度,公式为:(血管原有内径- 残存内径 /原有内径×100%。狭窄程度50%视为重度狭窄, 20%狭窄程度50%视为轻度狭窄。1.4 统计方法采用SPSS11.5统计软件进行统计分析。基因型和等位基因频率的差异用2检验。多因素分析用Logistic多元回归分析。2. 结果2.1各组临床特征的比较颈动

8、脉狭窄两组以及IMT增厚组的血浆总胆固醇、空腹血糖、高血压史和吸烟史均高于健康对照组(P值分别小于0.01、0.01、0.05而颈动脉病变三组间无差别。各组间一般资料见表1。表1 颈动脉粥样硬化各组和对照组的临床特征 (n=396.53±1.68 4.78±0.46 1.24±0.64 63(66.3 41(43.2轻度狭窄组(n=955.54±0.98 4.06±0.81 1.17±0.41 63(60.6 42(40.4IMT增厚组(n=1045.5±1.02 4.03±0.65 1.20±0.38

9、40(37.4 24(22.4对照组(n=1072.2各组CBST833C基因型及等位基因频率的比较因C/C基因型例数较少,与C/T基因型合并后分析。与对照组比较,CBS基因第833位点C/C+T/C基因型频率在颈动脉狭窄两个亚组均增高(分别X2=5.32,P<0.05和X2=8.67,P <0.01。IMT增厚组C/C+T/C基因型频率与对照组比较无显著性差异(X2=0.01,P>0.05。轻度狭窄组和重度狭窄组之间无明显差异(X2=0.01,P>0.05。比较各组C等位基因频率,颈动脉狭窄两个亚组较对照组增高(X2=4.18,P<0.05,和X2=8.01,P

10、<0.01, IMT增厚组较对照组无明显差异(X2=0.138,P>0.05。颈动脉粥样硬化组与对照组基因型及等位基因的分布见表2。表2 各组CBST833C基因型及等位基因频率组别等位基因频率C/C(%C/T(% T/T(% C(%T(% 重度狭窄组39 3(7.7 10(25.626(66.716(20.562(79.5(21.6 149(78.4轻度狭窄组95 9(9.5 23(24.263(66.3 41IMT增厚组104 5(4.8 11(10.688(85.6 21(10.1 187(89.9对照组107 7(6.5 10(9.3 90(84.1 24(11.2 190

11、(88.8与对照组相比,颈动脉狭窄两亚组CBS833C等位基因较T等位基因对颈动脉狭窄的OR 为3. 168 (95 %的可信限为1. 298 6. 778 , P = 0. 004。应用Logistic 回归校正了总胆固醇、空腹血糖、高血压、吸烟史后, C等位基因T等位基因对颈动脉狭窄的OR 为1.938 , P = 0.046。2.3 粥样硬化斑块稳定性与CBS基因多态性分析因C/C基因型例数较少,与C/T基因型合并后分析。CBS基因第833位点C/C+T/C基因型与对照组比较无明显差异(分别为2=1.50,P>0.05和2=1.44,P>0.05,两组间也无显著统计学意义(2

12、=0.0187,P>0.05。而C等位基因频率与对照组比较及斑块组两组间也无明显差异性(P>0.05。稳定斑块组及易损斑块组与对照组CBST833C基因型及等位基因频率见表3。表3 稳定斑块组及易损斑块组与对照组CBST833C基因型及等位基因频率组别 NCBST833C等位基因频率C/C(%C/T(% T/T(% C(%T(% 稳定性斑块组 73 4(5.5 12(16.4 57(78.1 20(13.7 126(86.3易损斑块组 41 3 (7.3 7(17.1 31(75.6 13(15.8 69(84.2对照组 107 7(6.510(9.390(84.124(11.2

13、190(88.83. 讨论颈动脉粥样硬化引起缺血性脑卒中的主要机制有:粥样硬化斑块不断增大,直接阻塞血管;斑块不稳定、破裂,破裂的斑块栓塞远端的血管,破裂或未破裂的斑块表面粗糙,血小板和凝血因子被激活,形成血栓,狭窄颈动脉使远端的灌注压下降,导致分水岭区供血不足,形成边缘带梗死或低灌注性梗死.高同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy血症已被证实是动脉粥样硬化性疾病的一个独立危险因素。高HCY血症的致病机制尚未完全阐明,一般认为可能与其对血管内皮细胞的毒性作用及增加血液中血小板的粘附性有关,HCY的氧化可产生自由基和过氧化氢,促使低密度胆固醇的氧化,增加泡沫细胞的形成,致使血管内壁增厚,

14、导致闭塞性脑血管疾病的发生。HCY尚能刺激血管平滑肌细胞的增殖,后者是动脉硬化形成的重要因素3-6。此外,Hcy 还能改变多个基因的表达, 而促进动脉粥样硬化 7。CBS是HCY 分解代谢过程的限速酶,其以VitB6作为辅酶,催化HCY与丝氨酸缩合胱硫醚,并进一步分解为半胱氨酸和-酮丁酸随尿液排出体外,以维持体内血浆HCY水平相对的稳定。一旦CBS基因突变引起酶活性改变,必然导致HCY 代谢异常, 可造成HCY在血液中蓄积而产生高HCY血症。关于CBS 变异的报道已超过了100 种, 多数是单碱基替换8。目前研究表明, CBS 部分变异位点呈现出明显种族和地域差异。在CBS 的变异中, 研究最

15、早和最广泛的是C833T,G919A ,两者均为发生在第8 外显子的错义突变, 分别导致肽链的第287 位的异亮氨酸转换为苏氨酸和第307 位的丝氨酸转换为甘氨酸中833位的突变,影响了酶与PL P 的结合力, 临床治疗表现为患者对Vit B6治疗不敏感。因此,Kozich 8等认为833C 是导致高同型半胱氨酸血症的恶性突变,而 Kraus8等却发现T833C在欧洲自然人群中存在高度的多态性, 有关T833C 突变分子机制已引起诸多研究者的高度重视。本试验中我们测得CBS 833C的基因频率为15.1%,与国内学者研究相符9,与国外研究相差较大。目前的研究表明,CBS833C 和CBS919

16、A 呈现明显的种族和地域的差异,CBS833C在非洲黑人和我国北方汉族人群中基因频率在20 %左右, 比欧洲高加索人种的基因频率高3倍10。动物实验11表明CBS活性降低的促进动脉粥样硬化的进展。但对CBS基因突变与缺血性心脑血管病的关系研究结果不一。Dillery, 11等研究发现美国人中CBS的G919A和CBST833C 基因突变与缺血性脑卒中发生有相关性. Tsai等12研究发现CBST833C、G919A这两个位点的突变可使CBS活性降低, 亦可产生高HCY血症,高HCY 血症与早发的冠心病有关,但进一步的研究中发现CBST833C、G919A突变在脑卒中组及对照组中无统计学差异。国

17、内邵燕3等学者研究认为、CBS G919A 基CBS T833C 基因多态性并非脑血栓形成的独立危险因素。已知脑梗死与心肌梗死在发病机理上具有一定的相似性, 印度学者13通过30名冠心病患者和138名对照的临床研究发现患者组中C等位基因对CBS833C冠心病起保护作用。国内研究结果与之截然不同,陈欣14等检测了107例冠心病患者和96例对照的CBS基因多态性认为CBS 基因T833C、G919A多态性与冠心病的发生有关。我们的研究结果显示,在颈动脉狭窄组CBS833C等位基因的频率明显高于IMT组和对照组,而T等位基因的频率则低于对照组,而与狭窄程度无关(重度狭窄组与轻度狭窄组比较,2=0.3

18、32.P>0.05。提示CBS833C等位基因是颈动脉狭窄的危险因素;经Logistic回归分析控制其他混杂变量的影响后,颈动脉狭窄两组C基因型高于对照组,提示C基因型可能为颈动脉狭窄的一个易感基因。而在颈动脉粥样硬化斑块稳定性方面,CBS833 C与T等位基因组成无统计学意义,提示CBST833C基因突变与颈动脉粥样硬化斑块稳定无相关性。本研究样本例数较少,有待于扩大样本量并增加与缺血性脑血管病危险因素之间的相关性研究从而揭示缺血性脑血管病及动脉粥样硬化的发病机制.参考文献1Timsit SG, Sacco RL ,Moh r JP, et al1Early clinical diff

19、erentiation of cerebral infarction from severe athero sclro tic steno sis and cardio embolism. Stroke, 1992, 23: 486-4912 Bostom A G, Silbershatz H, Rosenberg ZH, et al. Nonfasting p lasma to tal homocysteine levels and all causeand cardiovascular disease mortality in elderly F ram ingham men and wo

20、men J. Arch Intern Med, 2004;159 (24 : 1077-1080.3 邵燕,章成国,崔金环,同型半胱氨酸及其酶基因多态性与脑血栓形成的关系.中国康复理论与实践 .2005.vo11.No.8 :601-6044 Nishinaga M, Ozawa T , Shimada K, et al . Homocysteine , a thromdogenic agent , suppresses anticoagulantheparan sulfate expression in cultured porcine aortic endothelial cells. J

21、 Clin Invest , 2003 , 92 : 381 - 3865Woo KS, Chook P, Lo lin Y I, et al. Hypehomocysteinem ia is a risk factors for arterial endothelial dysfunction in homans J . Circulation,1997, 96: 2542-25446Stam ler JS,O sbo rne JA , Jarak iO , et al. A drersa vascular effects of homocysteine are modulated by e

22、ndo thelium-derived relaxing facto r and related oxides of nitrogenJ . J Ch in Invest, 1993, 91 (1 : 308-3137 Kokame K, Kato H,Miyata T. Nonradioactive differential display cloning of genes induced by homocysteinein vascular endothelial cellsJ. Methods, 1998, 16: 434-443.8 Kozich,Wilson B D, Gubler

23、D B, et al. Homocystine, a risk factor for premature vascular disease andthrombosis, induces tissue factor activity in endothelial cells J . Arterio sclerthromb, 1993, 13: 1327-1333.9 朱慧萍,赵如冰,李竹,等1 中国北方少数民族人群同型半胱氨酸代谢酶的遗传多态性J 中国优生优育,2000 ,11 (2 ,51 -53.10 Shan X, Christopher SA , Kruger WD , et al1 M

24、utations in the regulatory domain of cystathioninebeta-synthase canfunctionally suppress patient- derived mutations in cisJ . Human MolecularGenetics ,2001 , 10(6 :635 643。11 Liao D, Tan H, Hui R, Hyperhomocysteinemia decreases circulating high-density lipoprotein by inhibitingapolipoprotein A-I Pro

25、tein synthesis and enhancing HDL cholesterol clearance. Circ Res. 2006 Sep15;99(6:565-612 Tsai K, Chasse J F , Santiard2Baron D , et al. Altered gene expression in liver from a murine model ofhyperhomocysteinemia. J Biol Chem , 2003 , 278 : 1504 151113 Chandra G, Pal S, Cystathionine beta-synthase T

26、833C/844ins68 polymorphism and stroke。Neurol India. 2006Mar;54(1:48-50; discussion 51-2.14 陈欣,刘克强,穆红。胱硫醚- 合酶(CBS 基因与冠心病发病机制的研究. 天津医药2003 年3 月第31 卷第3 期:158-160 The correlation between Cystathionine - synthase gene polymorphism and carotid atherosclerosis Liu Fangqing，Zhang Chen Department of Neurolog

27、y，The Affiliated hospital of Qingdao University Medical College， Qingdao，ShanDong（266003） Abstract Objective：To investigate the correlation between Cystathionine - synthase (CBS gene polymorphism and carotid atherosclerosis in Chinese. Methods：238 patients with Carotid atherosclerosis and 104 control subjects were enrolled.