脑脉通对骨髓干细胞动员保护大鼠脑缺血损伤的影响

1、脑脉通对骨髓干细胞动员保护大鼠脑缺血损伤的影响 10-09-04 16:57:00 编辑：studa20作者：李建生 刘敬霞 张新峰 任伟宏 田玉收 王丁超【摘要】 目的 研究脑脉通对脑缺血大鼠骨髓干细胞动员 (BMSCs) 在血液和脑组织的变化及脑保护作用的影响。方法 大鼠随机分为假手术组、模型组、脑脉通组、动员组、脑脉通+动员组，线栓法制备MCAO动物模型。皮下注射人重组粒细胞集落刺激因子(rGCSF)；脑脉通灌胃用药。检测大鼠外周血WBC及CD34+、脑组织CD34+变化；观察神经功能和脑组织病理改变；测定脑组织含水量和脑梗死面积。结果 模型组大鼠外周血WBC(8.071.27)109/

2、L和CD34+细胞(3.170.75)个/l增加，3 d达到峰值，各治疗组增加更为明显；联合组2和3 d外周血WBC、各时间点CD34+细胞均较动员组增加。各模型组大鼠脑组织CD34+表达增强，7 d达到峰值(33.042.62)个/l；各联合组较动员组增强明显。各模型组大鼠神经评分降低、脑含水量增加、脑梗死面积增大、脑组织病理损伤明显，以7 d显著；动员组大鼠7和14 d的上述指标改善；各联合组较动员组的改善明显。结论 血液WBC数CD34+计数，脑组织、CD34+表达均显著显示，脑缺血可引起BMSCs进入外周血并向脑组织归巢，峰值时间存在差异；GCSF可使BMSCs分布增加；脑脉通使动员后

3、血液和脑组织BMSCs增多、脑组织峰值时间延长，且使其脑保护作用增强。 【关键词】 脑缺血；脑脉通；粒细胞集落刺激因子；骨髓干细胞 【Abstract】 Objective To explore the effect of Naomaitong on mobilization of bone marrow stem cells (BMSCs) in blood and brain tissue and the role in protecting brain in rats with cerebral ischemia. Methods Rats were randomly divided i

4、nto different groups. Middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was duplicated with nylon thread. Rats in groups of mobilization and model were administrated with rGCSF（10 g-1d-1）through subcutaneous injection before 3 d and after 2 d of operation respectively, once a day. Naomaitong was used th

5、rough intragastric administration. On 2, 3, 7 and 14 d after operation, rats blood were taken through abdominal aorta, then white blood cells (WBCs) and CD34+ cells in peripheral blood were determined. Expression of CD34+ cells in rats brain tissue were detected. Rats state, ratio of weight change a

6、nd general neural function score (GNFS) and brain pathologic change were observed, and then rats brain water ratio (BWR) and cerebral infarction size (CIS) were measured. Results Rats mortality increased after operation and the decreases of weight on 7 d were more obvious. Compared to model groups,

7、decreases of weight in treat groups abated. WBCs（8.071.27） and CD34+ cells（3.170.75） in peripheral blood in model group increased obviously and showed the highest level on 3 d after operation. Increases of WBCs and CD34+ cells in rats of treat groups were more obvious. In comparison with that of mob

8、ilization groups, rats WBCs on 2 and 3 d combination groups increased more significantly and CD34+ cells in each combination group were more higher. Expression of CD34+ cells in brain of rats in model groups increased and showed the highest level on 7 d （33.042.62）and the changes showed more obvious

9、 in each mobilization and combination group, especially in each combination group. Rats GNFS were lower in each model groups and BWR, CIS and brain pathologic increased obviously, especially on 7 d model group. The changes aboved improved significantly on 7 and 14 d mobilization groups. Compared to

10、the changes in mobilization groups, the improvement in each combination group showed more obvious.Conclusions BMSCs could enter peripheral blood and move towards brain tissue after cerebral ischemia and the peak is different. rGCSF could make BMSCs increase both in peripheral blood and brain. Meanwh

11、ile, Naomaitong could increase BMSCs which are mobilized and make the peak of BMSCs in brain prolong, as well as enhance the protection against brain injury after cerebral ischemia. 【Key words】 Cerebral ischemia; Rats; Naomaitong; GCSF; BMSCs骨髓干细胞(BMSCs)是具有自我更新和多向分化潜能的原始骨髓细胞，可分化为主要的几类神经细胞，被用于脑组织损伤的保

12、护和修复1。因符合机体自身的反应性修复机制，方法简便、安全且可避免异基因移植的免疫排斥反应，BMSCs动员在脑缺血损伤的应用方面显示良好前景2，3。粒细胞集落刺激因子(GCSF)是BMSCs有力的动员剂，可使脑缺血损伤后外周血和脑组织的BMSCs增加，并使其保护脑组织的作用增强。中药在骨髓干细胞动员保护脑组织受损方面研究有待进一步探索。我们前期研究发现，中药脑脉通(由大黄、人参、川芎、葛根组成)可增强BMSCs移植后的脑保护作用4，本研究拟就其对BMSCs动员后的分布变化及抗脑缺血损伤作用的影响进行探讨，为中药在BMSCs动员治疗脑缺血方面的应用提供依据。1 材料与方法1.1 材料SD大鼠，S

13、PF级，雌雄各半，34月龄，体重(30050)g，202只，由河南省实验动物中心提供合格证号：scxk(豫)20050001。人重组粒细胞集落刺激因子注射液(rGCSF，商品名瑞白，山东齐鲁制药厂，规格：150 g/支)；荧光标记单克隆抗体CD34+ (Santa Cruz产品)；羊抗大鼠IgG生物素(BA1005)、柠檬酸盐缓冲液(AR0024)、正常山羊血清封闭液(AR0009)、DAB 显色试剂盒 (AR1022)均由武汉博士德生物工程有限公司提供；脑脉通颗粒 (出膏率15%，由大黄、人参、川芎、葛根组成；河南中医学院药物分析学科提供，5 g/袋)。流式细胞仪(Beckman Coult

14、er Epics，XL)；数码相机 (Sony Corpatation，Japan，型号：DSCF717 2002)；光学显微镜(Olympus optical Co.LTD，japan，型号：PM10AD)；透射电子显微镜(Hitachi，Japan，型号 H7500)；图像分析系统ImageProplus 5.1(Media Cybernetics Inc，USA，型号41N510044800)。1.2 方法大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、脑脉通组、动员组、脑脉通+动员组 (联合组)。假手术组10只大鼠，其余4组均为48只；后4组根据取材时间又分为2、3、7、14 d组，每组大鼠1

15、2只。分别于术前3 d和术后2 d给动员组、联合组大鼠皮下注射rGCSF(10 gkg1d-1)；假手术组、模型组和脑脉通组大鼠皮下注射等容积的生理盐水，每天1次。假手术组、模型组、动员组分别于造模前4 d用生理盐水灌胃，脑脉通组和联合组以生理盐水制备的脑脉通悬浮液(40.5 mg/ml)灌胃(40.5 mg100 g-1 d-1)，造模前加灌胃1次，术后每日灌胃1次，直至取材 (灌胃容积为1 ml100 g-1d-1)，每周根据大鼠体重调整灌胃药物的用量和灌胃体积5。各组大鼠均于术前禁食12 h，不禁水。参照改良的Longa法用线栓阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血动物模型 (MCAO)6。

16、10水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰卧位固定大鼠，行颈前正中切口，左侧钝性分离颈总动脉(CCA)；分离颈内外动脉，穿线备用，结扎翼颚动脉，于颈外动脉近动脉分叉处剪口，栓线穿入颈内动脉，缓慢推进，直至感觉有阻力为止，穿线成功后缝合皮肤。假手术组除不穿入栓线外，其余操作相同。手术过程中保持大鼠肛温(37.00.5)，保持室温(261)。术后注射青霉素钠(1万U100 g-1d-1)，以防感染。假手术组大鼠术后14 d取材，其余各组分别于术后2、3、7、14 d观察大鼠一般状况，大鼠称重，进行神经功能评测；麻醉大鼠，腹主动脉取血5 ml，注入EDTA3K试管，流式细胞仪测定血白细胞计数及C

17、D34+细胞数量；4%多聚甲醛溶液经升主动脉进行灌注固定，取出全脑，4生理盐水冲洗3遍，除去积血，滤纸吸去表面水分，去除嗅球、小脑和脑干。冰盘上迅速分离大脑半球，弃去右侧，取左侧半球，从额极向后冠状切取脑组织3 mm，待测脑组织含水量；依次向后冠状切取脑组织1 mm，迅速投入备好的内盛2%的TTC溶液，37避光育孵30 min，然后用10%的甲醛固定15 min，观察染色效果，待测脑梗死面积；向后冠状切取2 mm厚的脑组织投入备好的内盛多聚甲醛的小瓶内固定，待做脑组织病理和免疫组化检测；其余标本液氮冷存。1.3 测定指标对术后苏醒至取材时死亡和存活大鼠进行计数，计算各组(包括2、3、7、14

18、d 4个时间点)死亡大鼠只数与总体(造模后死亡与存活大鼠总只数)的比率。大鼠死亡率=(死亡只数/死亡与存活只数总和)100%。分别于术后2 d至取材时间在相应时间点大鼠称重，采集数据的时间点数分别为2 d组(1个)、3 d(2个)、7 d(3个)、14 d(4个)，计算公式为：体重下降率=(术前体重-术后体重)/术前体重100%，体重增长率=(术后体重-术前体重)/术前体重100%。抗凝血液20 l用WBC稀释液稀释20倍，取20 l入血细胞计数盘的计数室，静置3 min，待WBC下沉，在低倍镜下计四角四个大方格的有核细胞，4格总和乘以50则为每立方毫米的有核细胞计数。抽EDTAK3抗凝腹主动脉血1 ml轻摇混匀，然后按试管编号，取样本全血50 l，加CD34荧光素5 l，轻混，摇匀后避光置室温20 min，加溶血素250 l，混匀，避光置室温10 min，加PBS液500 l，混匀，避光置室温10 min，离心1 500 r/min 5 min，弃上清，每管加盐水1 ml混匀，应用流式细胞仪进行检测，计数CD34+细胞平均值(个/l)。神经功能评测方法按文献7从自发运动、轻瘫实验、前肢运动功能检测、加强运动功能检测、痛觉、位置觉6个方面进行，总分为18分，症状越重，得