芽孢杆菌在肉鸡肠道中的生活状态和分布

1、芽孢杆菌在肉鸡肠道中的生活状态和分布Fate and dissemination of Bacillus species in gastrointestinal tract of broiler chickens张大伟1 王少杰1 郝永任1 楚杰1 韩秋霞2 宿英德3(1山东省应用微生物重点实验室，山东省科学院中日友好生物中心，济南，250014，2山东科技大学，3济南大吉饲料有限公司)摘要 本研究以20日龄AA肉鸡为研究对象，分别一次性或持续添加饲喂不同的芽孢菌剂，对鸡粪中芽孢数量的测定结果显示：饲喂菌剂后2-4小时，鸡粪中开始检测到芽孢的存在，12-20小时达到最高值，直至饲喂80小时后，

2、肠道内的芽孢基本排除。排出芽孢总量为饲喂芽孢总数的2.5-3.0倍，表明三种芽孢均在肠道内可以萌发，并可进行生长繁殖。对肠道不同部位中活性芽孢菌体数量的测定结果表明：芽孢进入小肠后即可开始萌发，并进行生长繁殖，在回肠附近达到高峰。关键词 芽胞杆菌；肉鸡肠道；芽孢萌发；分布芽孢杆菌在自然界中广泛存在于土壤、空气和水中，而且数量丰富。芽孢菌剂作为益生菌或肠道竞争抑制剂，除了可以改善、调整肠道菌群外，还可抑制有害细菌在肠道内膜的吸附和定殖1，饲喂动物日粮中添加一定比例的芽孢菌剂，还可明显降低料肉比。目前，芽孢菌剂在人和动物肠道疾病的防治中均取得了较好疗效，应用的菌株主要为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和

3、蜡样芽胞杆菌等。芽孢菌剂中，菌体主要以芽孢的形式存在，菌剂具有耐热、抗干燥等优点，便于运输和使用，但对于芽孢菌在人或动物肠道中的生活状态及其作用机理，也成为国际学术界研究的热点。Losick等于1998年首次展示了Metabacterium polyspora在豚鼠肠道中萌发和芽孢形成的电镜照片2，虽然，随后也有研究报道，没有在试验小鼠肠道中发现萌发的芽胞菌体3，但Simon等研究小组则通过对实验小鼠粪便中对芽孢的数量检测，利用RT-PCR，检测只在萌发芽孢菌体中表达的融合蛋白fisH-lacZ等研究结果，确定了芽孢可以在小鼠的小肠肠道内萌发，并进行一定的生长繁殖4，最新的研究结果显示，枯草芽

4、孢杆菌的芽孢，不但可以在动物的肠道内完成芽孢萌发、生长繁殖和芽孢形成等完整的生活周期，而且，芽孢形成时间较体外实验条件下缩短一半的时间，同时，利用分子手段还证实了芽孢和萌发的菌体均可吸附在实验动物的肠道内膜表面，并可激发免疫活性，同时该研究还在国际上首提出了芽孢杆菌也属于动物肠道微生态环境的一个组成成分5。以上方面的研究在我国尚属空白，为了使各类芽孢益生菌剂在我国畜牧养殖业中得到更好的应用，本研究以AA肉鸡为试验对象，通过对试验肉鸡粪便所含芽孢数量的分析和检测肠道各部位萌发菌体的数量，推断不同芽孢在肉鸡肠道中的萌发和生长状态。1 材料和方法1.1 材料 试验肉鸡20日龄AA肉鸡，网养，鸡粪中芽

5、孢含量测定实验，共分4组，每组6只，肠道内容物芽孢菌体含量测定试验，分4组，每组2只，分组及试验条件见表1。 试验基础日粮为济南正大公司肉鸡全价饲料。 芽胞菌剂由济南大吉饲料有限公司提供，菌剂芽孢含量均为20×108 CFU/克。表1 试验分组及其饲喂条件鸡粪测定分组菌剂饲喂条件肠道测定分组菌剂饲喂条件F-1无G-1无F-20.5克BA菌剂一次性饲喂G-2BA日粮+0.1%BAF-30.5克BL菌剂一次性饲喂G-3BL日粮+0.1%BLF-40.5克KB2菌剂一次性饲喂G-4KB2日粮+0.1%KB21.2 试验方法 鸡粪中芽孢数量的测定分别收集每组中不同取样时间的所有鸡粪样品，样品

6、用1000 ml生理盐水悬浮，经匀浆后，75热处理20分钟，震荡摇匀后，取1 ml，用生理盐水稀释一定倍数，LB培养基平板涂布100 ul，37培养36小时后进行菌落计数。样品芽孢含量（108 CFU）=菌落数×稀释倍数×10×1000/6×108 肉鸡肠道中活性菌体数量的测定试验肉鸡持续饲喂添加芽孢菌剂的日粮2天后，同时宰杀并解剖所有试验肉鸡，取出鸡肠，将每只鸡的肠道分为七段。其中包括十二指肠2段，小肠4段，盲肠1段。对各段肠道内壁分别用100ml已灭菌的生理盐水进行冲洗，收集洗液，合并同组的相同肠道部位的样品，匀浆搅匀，每段肠道内容物样品各取1 ml

7、，一份直接稀释至一定倍数后，取100 ul涂布LB平板, 37培养36小时后进行菌落计数；另一份样品75热处理20分钟后，用生理盐水稀释相同倍数后，取100 ul进行平板计数。样品活性菌体数量（108 CFU）=（未热处理样品菌落数 热处理样品菌落数）×稀释倍数×10×200/2×1082 实验结果2.1 鸡粪中芽孢数量的测定结果 不同取样时间的鸡粪样品中芽孢的数量测定结果（图1）图1 不同取样时间的鸡粪样品中芽孢的数量Fig.1 Spore counts in feces from broiler chickens in different sampl

8、ing time.表示添加KB2菌剂试验组的测定结果；表示添加BL菌剂试验组的测定结果；表示添加BA菌剂试验组的测定结果。 鸡粪样品中的芽孢总数将每组平均每只鸡的所有鸡粪样品中的芽孢数量累加后，为平均每只鸡的排出体外的芽孢总数，计算结果见表2。表2：平均排出芽孢总数的计算结果试验组F-2F-3F-4排出芽孢总数 (108 CFU/只)30.325.126.2饲喂芽孢总数(108 CFU/只)10.010.010.0排出总数/饲喂总数3.032.512.62表3 不同肠道区段活性菌体数量测定结果(108 CFU)肠道部位BABL KB2 十二指肠10.60 1.44 0.86 十二指肠21.34

9、 0.81 0.00 小肠15.75 5.10 2.42 小肠25.80 4.00 18.82 小肠32.79 3.70 26.40 小肠412.93 10.63 18.15 盲肠1.15 1.26 0.00 2.2 芽孢的活性菌体在肉鸡肠道中的分布 肉鸡肠道不同区段中活性菌体数量的测定结果（表3） 肉鸡肠道内已萌发的活性菌体分布检测结果（图2）图2 已萌发的芽胞菌体在肉鸡肠道中的分布Fig.2 Dissemination of germinated Bacillus spores in gastrointestinal tract of broiler chickens表示添加KB2菌剂试验

10、组的测定结果；表示添加BL菌剂试验组的测定结果；表示添加BA菌剂试验组的测定结果。3 结果讨论3.1 鸡粪样品芽孢数量的测定结果如下：实验肉鸡饲喂芽孢菌剂2-4小时后，鸡粪中开始检测到饲喂芽孢的存在，直至80小时后，肠道中的芽孢基本全部排出，证明芽胞菌在试验肉鸡肠道中有所滞留，同时排出的芽孢总数比饲喂芽孢总数提高了1.5-2倍，证明芽孢在肠道内能够萌发，并进行了一定程度的生长繁殖。3.2 对试验肉鸡不同肠道部位的活性菌体数量的测定结果如下：芽孢在试验肉鸡的小肠内开始萌发，并进行了繁殖，在小肠的后端数量达到高峰后，又重新转入休眠体的芽孢状态，完成了一个生活周期；试验所取的小肠3和小肠4部位，即回

11、肠附近可能是芽孢杆菌的主要生长繁殖和滞留场所。3.3 地衣芽孢杆菌BL和枯草杆菌BA在小肠的萌发部位较另一株地衣芽孢杆菌KB2提前，而且三种芽孢杆菌在小肠中的主要繁殖部位也略有不同，此结果预示复合芽孢制剂可能取得更好的应用效果。参 考 文 献1 Fuller, R. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 1991, 66:365-3782 Msther RA and Richard ML. Propagation by sporulation in the guinea pig symbiont Metabacterium polyspora. Proc. Natl. Acad. Sci. 1998, 95:10218-102233 Maria R et al. On the fate of ingested Bacillus spores. Research in Microbiology 2000, 151(5):361-3684 Simon MC et al. Bacillus probiotics: spore germination in the galtrointestinal tr