辛伐他汀降解实验研究

1、摘要 目的 探寻辛伐他汀在苛刻条件下的稳定性，并验证辛伐他汀的检验方法的可行性。方法 采用HPLC法对苛刻条件处理后辛伐他汀的含量与有关物质进行测定，并与原样进行对比分析。结果 含量项下连续进样5针标准峰面积的RSD为0.40%<1.0%，USP分离度洛伐他汀与辛伐他汀的分离度为5.7>3.0，EP分离度有关物质A与辛伐他汀分离度为5.9>4.0 结论 上述HPLC法系统适应性良好。辛伐他汀微粉前样品在氧化、酸解、碱解、高温、光照条件下不稳定。在避光、高湿条件下，相对稳定。关键字 辛伐他汀，高效液相色谱，有关物质，降解 目录 一、仪器与试剂.5 二、方法.5 2.1溶液配制.

2、52.2高效液相色谱方法的建立.5 2.3湿计含量和干计含量.6 2.4杂质限度.6 2.5系统适应性.7 2.6 含量和有关物质.7 三.结果.9 3.1 系统适应性.9 3.2 辛伐他汀降解实验结果.9 四、结论.11 五、附图 HPLC色谱图.13 参考文献.20前言 辛伐他汀(simvastatin)其药理作用是作为竞争性抑制剂抑制肝脏细胞内羟甲戊二酰辅酶A 还原酶(HMG-CoA reductase)活力, 限制HMG-CoA 向甲基二羟戊酸的转化, 从而减少内源总胆固醇的生物合成总量。与相同剂量的洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin) 和氟伐他汀(fl

3、uvastatin) 等其他HMG-CoA 还原酶抑制剂相比, 辛伐他汀可以更有效地降低血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-cholesterol)。辛伐他汀经口服后对肝脏有高度的选择性，其在肝脏中的浓度明显高于其他非靶性组织，辛伐他汀的大部分经肝组织吸收，主要作用在肝脏发挥，随后从胆汁中排泄。只有低于5%口服剂量的辛伐他汀活性结构在外围中发现，而其中95%可与血浆蛋白结合。本课题按辛伐他汀HPLC含量及有关物质降解实验方案，用辛伐他汀含量和有关物质检测方法来检测降解后的辛伐他汀（微粉前和微粉后），判断此HPLC方法是否适用于降解杂质的检测，是否具有稳定指示性，同时研究辛伐他汀（微粉

4、前和微粉后）在酸，碱，光照，氧化，高湿，高温等条件下的稳定性，探索辛伐他汀（微粉前和微粉后）在这些条件下可能的降解趋势。 正文一.仪器与试剂名称级别批号/含量（若适用）来源磷酸分析级20121212国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钾分析级20121024国药集团化学试剂有限公司乙腈色谱级I669430303MERCK双氧水分析级20121120国药集团化学试剂有限公司0.1mol/LHCL分级级20130524本实验室配制0.1mol/LNaOH分级级20130607本实验室配制水纯化水每日新鲜本厂制备洛伐他汀标准品1101-1/98.9%本厂标定辛伐他汀标准品1301/99.0%(USP)1

5、301/99.2%(EP)本厂标定样品B2121148（微粉前）B2121148-M1（微粉后）本厂生产电子分析天平METTLER XP205 已校正METTLER XP6 已校正光照仪ATLAS SUNTEST XLS+ 已校正高效液相色谱仪Agilent 1260 已校正pH计METTLER S20 已校正色谱柱信息Supelco C18 ,4.6×33mm ,3µmPN：58977 实验室ID：D0148二.方法2.1溶液配制 稀释剂： 0.01mol/L磷酸二氢钾（用磷酸调pH至4.0）-乙腈 = 40：60。 系统适应性溶液：取一定量的辛伐他汀和洛伐他汀对照品，加

6、稀释剂配制成辛 伐他汀浓度为1.5mg/ml、洛伐他汀浓度为0.015mg/ml的溶液。 标准溶液：精密称取辛伐他汀对照品75mg 至50ml容量瓶，用稀释剂溶解并 稀释至刻度。样品溶液：精密称取辛伐他汀样品75mg 至50ml容量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度。2.2高效液相色谱方法的建立 检测波长的确定 准确吸取25ug/ml样品溶液1ml，置于高效液相色谱进样瓶中通过二极管阵 列检测器(DAD)检测，在190nm360nm区间进行DAD全波段扫描。通过DAD 扫描结果显示样品在238nm附近具有最大吸收，综合考虑确定238nm为高效液 相色谱仪检测波长。 流动相的选择 通过对流动相的筛选和

7、优化，选择乙腈和稀磷酸作为流动相（1）乙腈和稀磷 酸 稀磷酸：精密量取1.0ml磷酸，加水稀释至1000ml。 色谱柱的选择 C18柱是比较常用的色谱柱，它的优点是固定相稳定，可使用多种溶剂。一 般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值范围广，另外从经济实用性 及样品的分离效果方面C18柱较为可取，因此我们选用了C18柱。色谱系统 色谱柱：Supelco 33 mm ´ 4.6mm 3µm C18 稀磷酸：精密量取1.0ml磷酸，加水稀释至1000ml。 流动相A： 乙腈：稀磷酸= 50：50 流动相B：精密量取1.0ml磷酸，加乙腈稀释至1000ml（0.1%磷酸

8、V/V）。时间(min)流动相A（%V/V）流动相B（%V/V）0 10004.510004.69558.0257511.5257511.61000131000 检测波长：238nm 流速：3.0ml/min 进样量：5µl 2.3 湿计含量和干计含量 进样系统适应性溶液，记录谱图：洛伐他汀相对保留时间约0.6，辛伐他汀相 对保留时间为1.0，两者之间分离度应不得少于3.0，标准溶液重复进样5次 的相对标准偏差应不得大于1.0%。 按下式计算辛伐他汀中C25H38O5的湿计含量： 湿计含量%=ru×Cs×PrsCu 式中：Cu，Cs分别是样品溶液与标准溶液中的配制

9、浓度（mg/ml） rs是标准溶液所对应的主峰响应值 ru为样品溶液所对应的主峰响应值 P为对照品的含量，% 干计含量计算公式：干计含量%=湿计含量%1-干燥失重 2.4杂质限度 进样5µl样品溶液，记录色谱图，测量所有峰响应，按以下公式计算杂质含量：100(ri /rs)ri /rs分别为样品溶液所获色谱图中单个杂质和所有峰面积之和。归一化计算：洛伐他汀和表洛伐他汀（杂质E+F）（注意如果洛伐他汀和表洛伐他汀都存在，该方法不能完全分离，这两个杂质峰的RRT约为0.6，可以合并积分计算）；辛伐（羟基）酸（杂质A）、亚甲基辛伐（杂质G）、辛伐乙基酯（杂质B）、脱水辛伐（杂质C）、辛伐二

10、聚物（杂质D）、其它单个未知杂质、总杂质(除杂质E+F)。杂质限度为0.03%，如果单个杂质的平均计算值少于该限度，则在报告中标明（<0.03%）。 相对保留时间：杂质A约0.45 0.5；洛伐他汀（杂质E）和表洛伐他汀（杂 质F）约0.60，杂质G约0.80，杂质B 2.2 2.3，杂质C约2.3 2.4，杂 质D约3.4 3.8。 2.5系统适应性USP分离度溶液：称取1.53mg洛伐他汀，150.12mg辛伐他汀至100ml容量瓶中，用稀释剂溶解稀释至刻度。EP分离度溶液：称取1.07mg洛伐他汀，1.16mg辛伐他汀至50ml容量瓶中，用稀释剂溶解稀释至刻度。鉴别溶液：称取EP鉴

11、别0.98mg加入1.0ml稀释剂溶解。标准溶液：精密称取辛伐他汀对照品75.75mg 至50ml容量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度。按照SOP描述中的方法，当色谱系统平衡后，进样空白、EP分离度溶液、USP分离度溶液、5针标准溶液，记录峰响应值，结果见表1 2.6 含量和有关物质 原样测定准确称取辛伐他汀样品微粉前B2121148：75.00mg、74.39mg，微粉后B2121148-M1：75.12mg、75.01mg分别置于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解定容至刻度。同时评价干燥失重。待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱并测定主峰纯度。 酸降解测定准确称取辛伐他汀样品微粉前B

12、2121148：75.42mg，微粉后B2121148-M1：75.11mg分别置于50ml容量瓶中，分别加入1.0ml稀释剂溶解后，再分别加入1.0ml 0.05mol/L盐酸，放置0.5h后，分别用0.05mol/L氢氧化钠溶液中和，用稀释剂稀释至刻度。待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱并测定主峰纯度。 碱降解测定准确称取辛伐他汀样品微粉前B2121148：75.35mg，微粉后B2121148-M1：75.03mg分别置于50ml容量瓶中，分别加入1.0ml稀释剂溶解后，再分别加入1.0ml 0.05mol/L氢氧化钠，放置0.5h后，分别用0.05mol/L氢氧化钠溶液

13、中和，用稀释剂稀释至刻度。待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱并测定主峰纯度。 氧化降解测定准确称取辛伐他汀样品微粉前B2121148：75.11mg，微粉后B2121148-M1：74.59mg分别置于50ml容量瓶中，分别加入1.0ml稀释剂溶解后，再分别加入1.0ml 30%双氧水，放置3h后，用稀释剂稀释至刻度。待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱并测定主峰纯度。 高温高湿降解测定（40/75%）称取辛伐他汀样品（微粉前B2121148、微粉后B2121148-M1）各约1200mg平摊于称量瓶中置于温度为40，湿度为75%的恒温恒湿箱中放置5天后取出，备用

14、。准确称取上述高温高湿降解辛伐他汀样品微粉前B2121148：75.02mg，微粉后B2121148-M1：75.15mg分别置于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解定容至刻度。同时评价样品干燥失重。待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱并测定主峰纯度。 高温降解测定（60）称取辛伐他汀样品微粉前B2121148约1200mg平摊于称量瓶中置于高温60的干燥器中室温放置5天后取出，备用。称取辛伐他汀样品微粉后B2121148-M1约1200mg平摊于称量瓶中置于高温60的干燥器中室温放置1天后取出备用。准确称取上述高温降解辛伐他汀样品微粉前B2121148：75.29mg，微粉后B212

15、1148-M1：75.11mg分别置于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解定容至刻度。同时评价样品干燥失重。待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱并测定主峰纯度。 光降解测定称取辛伐他汀样品（微粉前B2121148、微粉后B2121148-M1）各约1200mg分别平摊于称量瓶中置于光照度为600w/m2 光照箱内24h后，置于干燥器中冷却至室温，备用。准确称取上述光降解辛伐他汀样品微粉前B2121148：74.69mg，微粉后B2121148-M1：74.10mg分别置于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解定容至刻度。同时评价样品干燥失重。待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱并

16、测定主峰纯度。 避光样品测定除将样品外置一黑色PE袋，再外加一铝箔袋包装外，其余操作均等同于光降解实验。 准确称取上述避光降解辛伐他汀样品微粉前B2121148：75.23mg，微粉后 B2121148-M1：75.06mg分别置于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解定容至刻度。 同时评价样品干燥失重。待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱并测试主峰纯度。 三.结果3.1 系统适应性表1.系统适应性结果序号峰面积图谱编号17480.758320130062505.D27452.9648420130062506.D37424.6508820130062507.D47417.45117201

17、30062508.D57407.4628920130062509.D平均值7436.66/%RSD0.40/USP分离度(R)5.720130062503.DEP分离度(R)5.920130062502.D接受标准RSD1.0% R(USP)3.0 R(EP)4.0由上表实验结果可知，各项均符合规定，此方法系统适应性良好3.2 辛伐他汀降解实验结果 将上述降解条件下测得的结果汇总至下表，同时评价干燥失重。名称干燥失重（%）含量（%）主峰纯度因子图谱编号原样0.0398.9999.920130062517.D20130062518.D酸解96.7999.920130062521.D碱解85.39

18、99.920130062522.D氧化97.3999.920130062530.D高湿0.0499.2999.920130062532.D高温0.0399.1999.920130062535.D光照0.0397.7999.920130062538.D避光0.0599.2999.920130062540.D接受标准峰纯度990 表2微粉前（B2121148）各降解条件下的主成分峰纯度结果原样和各降解条件下的样品的主峰纯度因子均大于990，说明该方法的专属性及稳定性指示性良好。 表3微粉前（B2121148）各降解条件下已知杂质和总杂质结果汇总（%）名称AE+FGBCD总杂质原样0.09770.2

19、9680.10110.03970.06150.09420.6909酸解3.10140.29280.09620.03650.06480.09093.6827碱解14.25900.27140.09270.03600.08710.072214.8575氧化0.16180.29350.09530.03870.06160.09261.0474高湿0.10580.29630.09780.03590.06380.09220.6917高温0.06790.26890.08020.03760.06640.06310.6226光照0.10850.28990.09190.03910.06300.05411.0134避

20、光0.10050.29510.09750.03850.06360.09330.6885 表4微粉前（B2121148）各降解条件下未知杂质结果汇总（%）RTRRT碱解氧化高温光照0.2040.2040.07/0.13270.2440.08/0.08110.3410.12/0.05990.4590.16/0.0879/0.04130.5940.21/0.1875/0.6290.22/0.6820.24/0.9810.340.0391/4.3641.51/0.02860.03850.0530 “/”表示“未检出”表5微粉后（B2121148-M1）各降解条件下的主成分峰纯度结果名称干燥失重（%）含

21、量（%）主峰纯度因子图谱编号原样0.0399.0999.920130062519.D20130062520.D酸解95.2999.920130062528.D碱解84.5999.920130062529.D氧化97.8999.920130062531.D高湿0.0498.1999.920130062533.D高温0.0498.0999.920130062546.D光照0.0496.7999.920130062543.D避光0.0398.7999.920130062545.D接受标准峰纯度990原样和各降解条件下的样品的主峰纯度因子均大于990，说明该方法的专属性及稳定性指示性良好。表6微粉后（

22、B2121148-M1）各降解条件下已知杂质和总杂质结果汇总（%）名称AE+FGBCD总杂质原样0.06150.29040.08100.03670.05930.07440.6412酸解3.26460.31600.09880.03440.05970.07263.8815碱解14.15100.28530.08880.03570.08100.056314.7796氧化0.15620.32220.10220.04530.07450.07071.0279高湿0.13080.32300.09920.03640.05750.06880.7451高温0.10070.32840.09860.03290.0637

23、0.07390.7375光照0.08790.29250.08280.03330.06160.05401.3443避光0.07720.29440.08370.03090.06180.06880.6527表7微粉后（B2121148-M1）各降解条件下未知杂质结果汇总（%）RTRRT原样酸解碱解氧化高温光照避光0.2040.2040.07/0.2203/0.2440.08/0.1391/0.3410.12/0.0982/0.4590.16/0.0753/0.0871/0.5940.21/0.0491/0.6290.22/0.1394/0.6820.24/0.0441/0.9810.34/0.044

24、4/4.3641.510.03820.03550.03720.04210.03930.06470.0359 “/”表示“未检出”四、结论4.1 系统适应性及专属性 含量项下连续进样5针标准峰面积的RSD为0.40%<1.0%，USP分离度 洛伐他汀与辛伐他汀的分离度为5.7>3.0，EP分离度有关物质A与辛伐他 汀分离度为5.9>4.0，各项均符合规定，系统适应性良好。通过对主峰纯 度进行分析，原样及各降解条件下样品主峰纯度因子均大于990，说明该 含量方法的稳定性指示性良好。4.2 酸降解实验在酸降解0.5h条件下，辛伐他汀微粉前(B2121148)含量下降，有关物质A升高

25、，有关物质E+F,G,B,C,D均无明显变化，无新增杂质，总杂质升高。辛伐他汀微粉后(B2121148-M1)含量下降，有关物质A升高，有关物质E+F,G,B,C,D,均无明显变化，无新增杂质，总杂质升高。辛伐他汀微粉前和微粉后样品在酸解条件下均不稳定。4.3 碱降解实验在碱降解0.5h条件下，辛伐他汀微粉前(B2121148)含量下降，有关物质A升高，有关物质E+F,G,B,C,D等均无明显变化，同时新增1个未知杂质，总杂质升高。辛伐他汀微粉后(B2121148-M1)含量下降，有关物质A明显升高，有关物质E+F,G,B,C,D等均无明显变化，同时新增1个未知杂质，总杂质升高。辛伐他汀微粉前

26、和微粉后样品在碱解条件下均不稳定。4.4 氧化降解实验在氧化降解3h条件下，辛伐他汀微粉前(B2121148)含量下降，有关物质A升高，E+F,G,B,C,D等均无明显变化，同时新增3个未知杂质，总杂质升高。辛伐他汀微粉后(B2121148-M1)含量下降，有关物质A升高，有关物质E+F,G,B,C,D等均无明显变化，同时新增2个未知杂质，总杂质升高。辛伐他汀微粉前和微粉后样品在氧化降解条件下不稳定。4.5 高温降解（60）实验在高温降解（60）5天条件下，辛伐他汀微粉前(B2121148)含量无明显变化，有关物质A,E+F,G,B,C,D等均无明显变化，同时新增1个未知杂质，总杂质无明显变化

27、。在高温（60）1天条件下，辛伐他汀微粉后(B2121148-M1)含量下降，有关物质A上升，有关物质E+F,G,B,C,D等无明显变化，无新增杂质，总杂质升高。辛伐他汀微粉前和微粉后样品在高温条件下均不稳定。相比较微粉前样品，辛伐他汀微粉后样品在高温条件下稳定性更差。4.6 高温高湿（40/75%）降解在高温高湿40/75%降解5天条件下，辛伐他汀微粉前(B2121148)含量无明显变化，有关物质A,E+F,G,B,C,D均无明显变化，无新增杂质，总杂质无明显变化。辛伐他汀微粉后(B2121148-M1)含量下降，有关物质A升高，有关物质E+F,G,B,C,D等均无明显变化，无新增杂质，总杂

28、质升高。辛伐他汀微粉前样品在高温高湿条件下相对稳定，微粉后样品在高温高湿条件下是不稳定的。4.7 光降解实验在光降解24h条件下，辛伐他汀微粉前(B2121148)含量下降，有关物质A,E+F,G,B,C,D等均无明显变化，同时新增5个未知杂质，总杂质升高。辛伐他汀微粉后(B2121148-M1)含量下降，有关物质A升高，有关物质E+F,G,B,C,D等均无明显变化，同时新增6个未知杂质，总杂质升高。辛伐他汀微粉前和微粉后样品在光照条件下均不稳定。4.8 避光降解实验在避光降解24h条件下，辛伐他汀微粉前(B2121148)含量无明显变化，有关物质A,E+F,G,B,C,D等均无明显变化，无新

29、增杂质，总杂质无明显变化。辛伐他汀微粉后(B2121148-M1) 含量无明显变化，有关物质A,E+F,G,B,C,D等均无明显变化，无新增杂质，总杂质无明显变化。辛伐他汀微粉前和微粉后样品在避光条件下相对稳定。4.9 从以上降解实验可知，辛伐他汀微粉前样品在氧化、酸解、碱解、高温、 光照条件下不稳定。在避光、高湿条件下，相对稳定。其中，辛伐他汀有关 物质A在酸解、碱解、氧化条件下不稳定，在高温、高湿、光照、避光条 件下相对稳定，其余各杂质均相对稳定。辛伐他汀微粉后样品在氧化、酸解、碱解、高温、高湿、光照条件下不稳定。在避光条件下，相对稳定。其中有关物质A在酸解、碱解、氧化、高湿、高温、光照条件下不稳定，在避光条件下相对稳定。其余各杂质均相对稳定。相比较微粉前样品，微粉后样品在受热后，样品稳定性较差。高湿实验显示样品无吸湿性，原样及各降解条件下样品主峰纯度因子均大于990，说明该方法专属性及稳定性指示性良好。五、附图 HPLC色谱图各降解条件下典型图谱拷贝如下：图1 溶剂图2 酸碱空白溶液图3 氧化空白溶液图4 标准溶液图5 0.5%对照溶液图6 样品溶液（微粉前B2121