重组人亲环素A的表达纯化1104班吴敌

1、Cyclophilin A的表达及纯化报告题目 Cyclophilin A的表达及纯化作者姓名 吴敌班级学号 1104班2011114020409指导教师 张新潮完成时间 2014年11月 生物学实验教学中心 重组人亲环素A(rhCyPA)的表达纯化吴敌（指导老师：张新潮）（湖北师范学院生命科学学院生物技术1104班 湖北 黄石 435002）摘 要：将亲环素A基因片段插人原核表达载体pET 中, 得到重组质粒p ET-CyPA , 转入大肠杆菌获得高效表达。重组有CyPA基因的大肠杆菌M15在含有氨苄青霉素（100ug/ml）和卡那霉素（25ug/ml）的LB培养基中培养，当A600达到大约

2、0.5时，终浓度为1mM的异丙基硫代B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养6h，再经过收集菌体、离心、重悬、超声波破壁、离心后得到蛋白粗提液。蛋白粗提液经SephacryTM S-100分子筛层析和DEAE-Sepharose CL-6B柱层析得到纯化的重组人CyPA。关键词：重组人亲环素A ; 基因表达; 层析;引言 CyP18是最早发现的亲环素类蛋白，分子量为18000，也称CyPA，存在于细胞质、核膜及高尔基体中，具有亲环素家族的典型特征，是Cyps家族中最丰富的一种，约占细胞总蛋白的0.1%一0.4%1。人的CyP18由165个氨基酸组成，由X-衍射可知2，CyP18的主要二级结构以-折

3、叠为主，并伴有-螺旋、-转角及无规线团，8条反平行的-折叠片段分别与环(Loop)和包埋于件折叠片段两端的3条-螺旋相连接，形成一个右手R-桶型结构，内部形成疏水中心。 亲环素A (Cyclophilin A CyPA)具有肤基脯氨酸顺/ 反异构酶(PPIase) 活性和结合免疫抑制剂环抱素A 的能力3,4。后来发现CyP是一个在进化上相当保守、功能相关的蛋白质家族, cyPA 是这个家族中最主要的成员。近年发现全身性红斑狼疮等自身免疫病人体内存在抗CyPA自身抗体, 检测CyP 抗体有助于了解自身免疫病的发病机制和进行临床诊断5 . 这些工作都需要大量纯化的人CyPA。用大肠杆菌体外表达人C

4、yPA, 能满足这些工作需要, 避免了从人组织提取纯化的麻烦。此外, 利用基因克隆表达技术还能进行定点突变, 作为其结构、动力学和作用机制研究的辅助手段。本研究在对CyPA 基因进行了克隆和序列测定的基础上, 构建了表达载体, 在大肠杆菌中获得高水平表达6。1.实验材料与试剂1.1实验材料c115a菌种（大肠杆菌）1.2抗生素储备液氯苄青霉素储备液：用无菌二次重蒸水配成100mg/mL氨苄青霉素（ampicillin，简称Amp）溶液，分装，-20°C保存备用。使用时每毫升培养基加入0.71mL，终浓度为70100mg/mL。卡纳霉素储备液：用无菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素

5、（kanamycin，简称Kan）溶液，分装，-20°C保存备用。使用时每毫升培养基加入35mL，终浓度为3050mg/mL。1.3IPTG储备液将2g异丙基硫代-D-半乳糖苷（isoprophyl thio-D-galactoside，简称IPTG），溶于二次重蒸水中，过滤除菌，分装，-20C保存备用1.4缓冲液 不同浓度的Tris-Hcl缓冲溶液1.5 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂用量12%Gel5ml双蒸水1.6ml30%丙烯酰胺2.0ml1.5M Tris-Hcl（pH=8.8）1.3ml10%SDS0.0510%过硫酸铵0.05TEMED0.002浓缩胶（5%Ac

6、rylamide）1双蒸水1.430%Acrylamide0.331.0M Tris-Hcl0.2510%过硫酸铵0.0210%SDS0.02TEMED0.02 实验方法2.1活化菌种取洁净的试管一支，加入6ml LB液体，并用10ul的枪头注入3ul kana以及6ul Amp这两种抗生素溶液后，再加入120ul c115a菌种，在37c下150r/min培养过夜2.2接种扩大培养 100mlLB液体+100ulAmp+50ul Kana+6ml菌液，在37c下180r/min培养3小时至OD值为0.5左右后加入100ul IPTG诱导物诱导，继续在37c下180r/min条件下诱导5-6小

7、时后。2.3蛋白质提取将菌体培养液转移到250ml的大离心瓶中，在5000rpm条件下离心8分钟弃取上清液，并将5xTris-Hcl缓冲溶液（pH=7.8）稀释到一倍体积后，加入30ml的1x缓冲液洗涤菌体，并转移到30ml的离心管中在装有碎冰的烧杯中进行超声波破壁处理（每工作2s，间隔3s，功率为50%）4次在将破壁后的溶液分装到两个小离心瓶中，在4c下12000rpm离心10min取上清液转到小烧杯中，并在冰箱中保存。2.4层析凝胶的溶胀装柱平衡样品制备上样(1x体积的缓冲液)洗脱（先校准，在加样，速率为4min一管）收集液体（观察显示器上的图线趋势并记录出现波时的管）还原2.5电泳1）制

8、作凝胶，并用水相液封，胶体凝固后制备浓缩胶并插上梳子2)将loading buffer5ul与20ul的蛋白混和进行电泳，先是电压为60v，在 蛋白跑到浓缩胶处换电压140v直到跑完整个胶板3）在考马斯亮蓝液体中加热至煮沸停止加热，使染色。4）在清水中煮胶，至能够看到条带停止加热。重复两次5）在冷水中漂开，在扫描仪下扫描，可以观察到蛋白的印迹。6）保存结果3 结果与分析3.1蛋白电泳图第一次电泳选择的是2,4,6,8,10,12,14,16,20,22,24，其中12管没有蛋白，14号出现有蛋白，22号管以后没有蛋白出现，最纯为16号管。结果说明了：13管可能存在有蛋白，14管以后到22号这一

9、段都含有蛋白，可以进行检测，用于说明目的蛋白的存在。第二次电泳结果选用的是buffer，初提液，13管，混合液（14,15,16,17,18,19,20,21,22），第二次提取液结果表明：初提液中含有较多的杂蛋白，13管有蛋白出现，混合液中蛋白较为专一。3.2蛋白层析图谱 4.总结与讨论采用DEAE阴离子柱层析和SephacryTMS-100分子筛层析进行蛋白质纯化，得到电泳纯的均一蛋白。通过本次的学习，了解到关于人亲环素的概念以及应用的方向，并且成功构建出了重组CyPA，经过诱导表达出了蛋白，并通过纯化，得到了更多的蛋白产物。在实验过程中也学习到很多实验操作技术，比如说电泳跑焦的前序准备工

10、作其中使用到了细胞破碎仪，对于仪器的使用有了进一步的了解等。实验过程细致严谨的实验要求也让人受益匪浅。而且实验也能够成功地构建出了重组CyPA，经过诱导表达出了蛋白，通过纯化，得到了更多的蛋白产物。参考文献1 郭敏杰, 张晓滨, 宓怀风. 亲环素的研究进展J. 免疫学杂志, 2004, 20(4):321-327. 2 (美)萨姆布鲁克（Sambrook,J.）等著, 黄培堂等译. 分子克隆实验指南M, 第三版, 科学出版社 2002 :1713-1720.3 Fischer G, Bang H, Mech C. Biomed Biochim Acta, 1984, 43: 1101.4 Handsehumaeher R E, Harding M W, Rice