hplc方法测胆汁酸含量方法汇总

1、HPLC 方法测胆汁酸含量方法汇总反相高效液相色谱法测定鼠胆汁中游离与结合型胆汁酸( 一 ) 试验仪器Ardent LC-1100 高效液相色谱仪，附荧光检测器 (A gilent 公司，美 国);Waters Nova C18色谱柱(X 150 mm, 51.卩 m) ( Waters 公司美国)， 保护柱及C18柱芯(Phenomenme)公司美国);ChromabondC18固相萃取小柱 (M acherey- Nagel) 公司德国 )。( 二 ) 试验试剂4-嗅甲基-7-甲氧香豆素(BM C)、18-冠醚-6(DCC) , a -鼠胆酸 (a -MCA) , B -鼠胆酸(B -M

2、CA)、熊脱氧胆酸(U DCA)、胆酸(CA)、猪脱氧 胆酸(H DCA )、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)甘氨胆酸(GCA)、甘氨 鹅脱氧胆酸(GCDCA标准品及胆酞甘氨酸水解酶均购自美国sig m a公司。甲醇、乙睛(色谱纯，美国天地公司 ) ，月桂酸(分析纯，上海化学试剂公司 )，氢氧 化钾、磷酸二氢钾 ( 分析纯，成都化学试剂厂 ).( 三) 色谱条件流动相:A相，甲醇：乙睛为1:2( V/V) ; B 相,超纯水；梯度洗脱程序：65%A (08min) , 80%A(816 min) , 90%A(1620 min);柱温：20 C ；流速:1 mL/ min;激发波长:

3、330nm；发射波长：400nn。( 四) 样品处理样品预处理：取鼠胆汁20卩L,加入120卩mol/ L月桂酸甲醇液 50卩L,再加入乙睛2 mL,充分混匀，超声 20 min, 10 000 g 离心10 min , 取上清液，在60 C氮气下吹干。胆汁酸的提取 : 测定游离与甘氨结合型胆汁酸时,将预处理吹干后 的胆汁样品溶于 2 mL L 磷酸盐缓冲液 (pH 7) ,加至已活化的固相萃取C18小柱上(用2 mL甲醇和5 mL蒸馏水依次活化 C18小柱)，再用10 mL 蒸馏水淋洗小柱，最后用 3mL甲醇洗脱胆汁酸.测定牛磺结合型胆汁酸时， 向预处理吹干后的胆汁样品中加入 1 mg胆酞甘

4、氨酸水解酶，再加入0. 025 mol/ L的磷酸钾缓冲液(pH mL,避光37C反应30 min，再加入mol/L磷 酸盐缓冲液(pH 7) 2 mL终止反应.然后加至已活化的固相萃取 C18小柱上， 其余步骤同测定游离与甘氨结合型胆汁酸 .胆汁酸的衍生与测定：向胆汁酸洗脱液中加入150卩L 1. 8 mmol/ L KOH甲醇液于60 C氮气下吹干，然后加入10 mmol/ L BMC乙睛液与5 mmol/ LDCC乙睛液各50卩L,密闭，37C条件下反应30min,取10卩L进样分析.高效液相色谱滓联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆酸（一）试验仪器AP I 2000 质谱仪（加拿大 A

5、 pplied Biosystens 公司）,配备 Perk in E Inmer 200 泵和 tubro 离子源;A tlantisdC色谱柱，150 mm X mm,5卩m（美国 Waters公司），保护柱及C8柱芯（美国Phenan enex公司），Chrcm abond C18 ec （ 3 mL /200 m g 德国 M achere-N agel 公司），M illpore 纯水装置（美国M illpore 公司）。15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱 纯（Sigma公司）；甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯（美国Tedia公司）。（二）试验试剂15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯（Si

6、gma公司）;甲醇、乙睛和 甲酸均为色谱纯（美国Tedia公司）。（三）色谱条件柱温:25 °C；流速:1 m L /min 分流比为1:4 ;流动相A: 5 mm o 1/L 醋酸铵和甲酸水溶液；B: 5 mm o 1/L醋酸铵和0 01%P酸甲醇溶液。梯 度洗脱程序为:Omin （80% B） 9min% B） 10 m in （ 80% B） 15 m in （80 % B ）。（四）样品处理蛋白沉淀法：800 L乙睛中加入300 L血清，混匀1 min,超声 30min以15000 X g离心15min,取900L上清液60C氮气吹干，其余同 固相萃取。固相萃取法：依次用1

7、mL甲醇,甲酸溶液活化固相萃取小柱。1 mL% 甲酸溶液中加入300 L血清，混匀1 min后上小柱。依次用1 m L %甲 酸溶液、1 mL甲醇水溶液（45: 55, V /V）冲洗。在重力作用下滴干后， 真空抽干。再用L 5 mL甲醇洗脱，洗脱液在600C氮气吹干，残余物溶于 100 Z 流动相（A: B= 20: 80，V/V）中，漩涡混匀lmin超声2min。取20卩L进行H PLC-MSIMS析，检测时间15min。三、高效液相色谱法同时测定胆汁中9种结合型胆汁酸（一）试验仪器Shimadzu 2010LC- AHT高效液相色谱仪，附紫外检测器（日本Shimadzu公司）;Aglie

8、 nt 固相萃取装置（美国 Aglie nt 公 司）;Millipore纯水装置（美国 Millipore 公司）；Chromabond C18固相萃取小柱（德国Maeherey- Nagel公司）;牛磺熊脱氧胆酸 CTauroursodeoxycholic acid TUDCA）、牛磺胆酸（CTaurocholic acid TCA）、甘 氨胆酸（Glycocholic acid,GCA）、甘氨 石胆酸 （Glycol-ithochdic acid, GLCA）、甘氨脱氧胆酸（Glycodeoxycholicacid,GDCA）牛磺脱氧胆酸（CTaurodeoxycholic acid T

9、DCA）、甘氨鹅脱 氧胆酸（Glycochenodeoxycholic acid GCDCA）、牛磺鹅脱氧胆酸门， aurochenodeoxycholic acid, TCDCA、牛磺石胆酸 CTaurolithocholic acid TLCA）标准品均购自美国sigma公司；甲醇、乙睛（色谱纯，美国 Tedia公司），其余试剂均为分析纯。（二）试验试剂牛磺熊脱氧胆酸 CTauroursodeoxycholic acid TUDCA、) 牛磺胆酸 (CTaurocholic acid TCA) 、甘氨胆酸 (Glycocholic acid,GCA) 、甘氨 石 胆 酸 (Glycol-i

10、thochdic acid, GLCA) 、 甘 氨 脱 氧 胆 酸 (Glycodeoxycholic acid,GDCA)牛磺脱氧胆酸(CTaurodeoxycholic acid TDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(Glycochenodeoxycholic acid GCDCA)、 牛磺鹅脱氧胆酸门， aurochenodeoxycholic acid, TCDCA) 、牛磺石胆 酸CTaurolithocholic acid TLCA)标准品均购自美国sigma公司；甲醇、 乙睛(色谱纯，美国 Tedia 公司) ，其余试剂均为分析纯。( 三 ) 色谱条件谱柱为 Waters Nova C1

11、8柱 mm x 150mm, 5卩m),流动相为甲醇 一 60 mmol/L磷酸盐缓冲液(66:34,v/v) ,pH，等度洗脱，柱温25C, 流速：ml/min;检测波长:197 nm ,进样量为10卩L。(四) 样品处理方法1:取胆汁样品25卩L,加入乙睛ml，旋涡震荡混匀，超声20 min,10 000g/min 离心10min，取上清液2 ml, 60 °C氮气下吹干。将预 处理吹干后的汁样品溶于 2 ml mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH ，加至己活 化的固相萃取C18小柱上(预先用2 ml甲醇和5 ml蒸馏水依次活化C18 小柱) ，再用 10 ml 蒸馏水淋洗小柱，最后

12、用 3 ml 甲醇洗脱胆汁酸。 洗脱液在60C氮气下吹干后溶于200 yL流动相，超声30 s,IO卩L进 样。四、血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定( 一 ) 试验仪器1100 型高效液相色谱 -质谱联用仪 (Agilen t 公司)，配备四 元梯度泵， 100位自动进样器，荧光检测器，在线真空脱气机，大气压 化学电离源(APCI); H ypersil C 18色谱柱 mm X 200 mm, 5卩m,中国科 学院大连化学物理研究所 ) 。 1, 2-: 苯并-3,4- 二氢咔唑一 9-乙基对甲 苯磺酸酯 (自制); 胆汁酸标准样品 (Sigma 公司); 无水乙睛 (禹城化学试

13、 剂厂) ，用 P2O5 干燥后蒸馏处理，二甲基亚矾经减压蒸馏后备用 ; 柠檬 酸钾、酒石酸钠等均为分析纯， 实验用水由 Milli-Q 超纯水系统制备。( 二 ) 试验试剂 标准溶液的配制：准确称取定量胆汁酸标准品，用乙睛配成 L 的 溶液。称取 m g 的 1, 2-: 苯并-3,4 二氢咔唑一 9-乙基对甲苯磺酸酯 (BDETS)用二甲基亚矶定容至I Om L,浓度为mo1/L。相应低浓度的衍生试剂 (500y mol/L) 标准溶液用二甲基亚矾稀释， 低浓度胆汁酸 (50y mol/L) 标准溶液用无水乙睛稀释而成。（ 三） 色谱条件色谱柱:H ypersil C18色谱柱 mmX 2

14、00 mm,5 卩 m ）。流动 A: 50% 乙睛水溶液 （含有 40 mm o 1/L 的 HCOON4,HpH = ; B: 100% 的乙睛。 梯度洗脱程序为（0%B 35 min线性梯度到70%B到40 min线性梯度到 10（plo B, 100%B 再运行15min流速为min柱温300E。荧光激发波长 和发射波长分别为：入ex = 333 nm,入em=390 nm.质谱条件 :1100 型高效液相色谱领谱联用仪 ; 大气压化学电离源 （APC I）,正离子模式，喷雾压力 M Pa;干燥气流量为5 L /min 燥气 温度350E，气化温度450C;毛细管电压3500V,电晕电

15、流4000nA（ 四 ） 样品处理标准品的衍生过程：盛有 500 m g 柠檬酸钾催化剂的安培瓶中依 次加入100 mL DM S0, 50 yL混合胆汁酸溶液，150 L衍生试剂溶 液，封口后于95C恒温水浴下振荡反应30min取出放冷后加入300 yL 乙睛混合均匀，取上层溶液用乙睛水溶液 （CH3CN /H20, 1：1, V/V） 稀释 5 倍直接进样分析。血清中胆汁酸的提取：向盛有2 mL血清样品的离心试管中加入3 mL 甲醇并振荡摇匀，然后加入硫酸按固体超声振荡，离心后取出有机相 用氮气吹干，剩余物用300 mL DM SO溶解后加入mL水。然后用经过 4m L甲醇和5m L水冲洗

16、的Sep-Pak萃取柱过滤，再用5 mL水冲洗 萃取柱，然后用5 mL乙睛将胆汁酸洗脱，将洗脱液挥发至干用 300 mL DMS溶解冷藏备用。五、柱前衍生反相高效液相色谱法测定血清中 9 种胆汁酸（ 一） 试验仪器LC-6A高效液相色谱仪，RF-535荧光检测器（日本，岛津公司）;玻 璃管均硅烷化。（ 二） 试验试剂胆酸（CA）、脱氧胆酸（DCA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）熊脱氧胆酸 （U DCA）、石胆酸（LCA）、甘氨胆酸（GCA）、甘氨脱氧胆酸（GDCA）甘 氨鹅脱氧胆酸 （GCDCA） 甘氨石胆酸 （GLCA） （ Sigma aldrich 公司）。 BM C（4-溴甲基-7-甲氧基香

17、豆素）,DCC（18-冠醚-6） （ Sigma aidrich 公司），甲醇、乙睛（色谱纯，美国天地公司 ），氢氧化钾、磷酸二氢钾、 月桂酸均为国产分析纯。（ 三） 色谱条件Waters Nova Ci8色谱柱 X 150 mm, 5 y m）。柱温 25 °C。荧光检 测：激发波长330 nm,荧光波长410 nm。流动相A:三蒸水；流动相B: 乙睛：甲醇=2: 1（ V/V），流速1 mL/ min,梯度洗脱程序:0. 0 min,65% B; 8. 0 min, 65% B; min, 80% B; min, 80% B; 19 min, 90% B; 24 min, 90% B 。以月桂酸为内标定量。（四） 样品处理将40 y mol/L内标液50 yL力卩到250 y L血清中