有效治疗自身免疫性疾病新靶标及相关新药研发

1、有效治疗自身免疫性疾病新靶标及相关新药研发 治疗自身免疫性疾病的新靶标：通道治疗自身免疫性疾病的新靶标：通道 靶向通道的先导药物研发靶向通道的先导药物研发 靶向先导药物在预防和治疗自身免疫疾病靶向先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用中的应用 自身免疫疾病自身免疫疾病自身免疫性疾病（autoimmune diseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。 系统性自身免疫病（非器官特异性）系统性自身免疫病（非器官特异性）器官特异性自身免疫病器官特异性自身免疫病系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus)类风湿性关节炎（rheumat

2、oid arthritis）口眼干燥综合征 (Sjogrens syndrome)结节性多发性动脉炎 (polyarteritis nodosa)慢性淋巴细胞性甲状腺炎 (Hashimotos thyroiditis)多发性硬化症 (multiple sclerosis)重症肌无力 (myasthenia gravis)胰岛素依赖型糖尿病 (insulin-dependent diabetes mellitus)临床上主要的自身免疫病及其相关证据直接证据间接证据疾病自身抗体传递疾病母体 输入传递 动物SCLD小鼠中输入细胞引起疾病自身抗原在实验动物中诱发疾病病变中证实有抗体或 T 细胞(抗体

3、T细胞)实验动物中输入淋巴细胞引起疾病动物模型证实有自身抗体或自身反应性T 细胞器官特异性重症肌无力+ + +甲状腺机能亢进+ +桥本甲状腺炎+ +胰岛素依赖性糖尿病+恶性贫血+艾迪森病+天疱疮 +原发性胆汁肝硬化+多发性硬化症(+) +非器官特异性自身免疫溶血性贫血+特发性血小板减少症 +肺肾综合征+类风湿关节炎+ +干燥综合征+系统性红斑狼疮+硬皮病+肌皮病+人类自身免疫病的致病性自身抗原疾 病自 身 抗 原桥本甲状腺炎甲状腺球蛋白原发性粘液水肿第二胶体抗原（CA2） 、胞质微粒体、细胞膜甲状腺功能亢进症细胞表面 TSH 受体恶性贫血内因子、壁细胞微粒体艾迪森病肾上腺细胞胞质过早停经类固醇

4、产生细胞胞质男性不育精子胰岛素依赖性糖尿病胰岛细胞胞质、细胞表面物质多发性硬化症脑肺肾综合征肾小球和肺血管基膜寻常天疱疮上皮棘细胞间的桥粒类天疱疮基膜晶状体源性色素膜炎晶状体交感性眼炎眼色素膜重症肌无力骨骼肌和心肌中乙酰胆碱受体自身免疫性溶血性贫血红细胞原发性血小板减少性紫癜血小板原发性胆汁性肝硬化线粒体（主要）慢性活动性肝炎平滑肌、细胞核、细胞表面蛋白溃汤性结肠炎结肠脂多糖干燥综合征腺管、线粒体、细胞核、甲状腺、IgG类风湿关节炎IgG、类风湿关节炎相关核抗原（RANA） 、胶原蛋白盘状型红斑狼疮细胞核肌皮病IgG硬皮病可提取的细胞核混合结缔组织病DNA系统性红斑狼疮核蛋白、细胞质中可溶性抗

5、原、其他抗原：血液中有形成分、凝血因子、华氏抗原全球有5-8%的人口受到约40种自身免疫疾病的威胁！自身免疫疾病已被我国列为“十大”严重影响人民健康的疾病之一。系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎类风湿性关节炎 多发性硬化症多发性硬化症 自身免疫病的共同特征自身免疫病的共同特征1、 多数自身免疫性疾病病因不明；2、患者女性多见，发病率随年龄增高，有 遗传倾向；3、存在自身抗体和（或）自身反应性T细胞；4 、疾病的重叠现象；5、病程迁延，发作与缓解交替；6、免疫抑制剂治疗有一定疗效 自身抗原的出现自身抗原的出现 隐蔽抗原的释放 、自身抗原发生改变 免疫调节异常免疫调节异常 淋巴细胞的多克

6、隆激活、Th1和Th2细胞功能失调 交叉抗原交叉抗原 链球菌感染、 EB病毒感染、柯萨奇病毒感染 表位扩展表位扩展 遗传因素遗传因素发病机制发病机制免疫耐受性的终止和破坏是自身免疫病发生的根本机制。确切原因尚未完全阐明，可能与下列因素有关：发病机制发病机制治疗策略治疗策略免疫抑制剂免疫抑制剂皮质激素：强的松，可的松皮质激素：强的松，可的松细胞毒性药物：烷化剂，嘌呤拮抗剂等细胞毒性药物：烷化剂，嘌呤拮抗剂等抗感染抗感染抗菌素：环孢子菌素、氯霉素抗菌素：环孢子菌素、氯霉素细胞因子及受体抗体或阻断剂细胞因子及受体抗体或阻断剂生物学制剂：抗淋巴细胞球蛋白、细胞因子单抗、细胞因子生物学制剂：抗淋巴细胞球

7、蛋白、细胞因子单抗、细胞因子受体拮抗剂受体拮抗剂 u缺点：不能根治，且对肝脏和肾脏有毒性，长期使用有缺点：不能根治，且对肝脏和肾脏有毒性，长期使用有致感染和致癌作用，导致不育和畸形，副作用强致感染和致癌作用，导致不育和畸形，副作用强n理想的治疗策略理想的治疗策略：选择性的抑制自身免疫而不影响正常免疫功能，毒副作用弱选择性的抑制自身免疫而不影响正常免疫功能，毒副作用弱T细胞引起自身免疫的信号通路细胞引起自身免疫的信号通路T细胞和自身免疫疾病细胞和自身免疫疾病选择性抑制选择性抑制T细细胞的激活和增胞的激活和增殖的免疫抑制殖的免疫抑制剂可以有效的剂可以有效的治疗自身免疫治疗自身免疫疾病。疾病。 电压

8、门控钾通道亚型中等电导钙激活钾通道(IKCa1) T细胞中的钾离子通道细胞中的钾离子通道与钾通道和与钾通道和IKCa1相关的相关的 T细胞激活过程细胞激活过程T细胞的分类细胞的分类 根据T细胞表面CD45分子，将T细胞分为二个新亚群。凡未经抗原刺激的T细胞可称之为原始T细胞（naive T cell,Tn）为CD45RA+T细胞群，而经抗原刺激分化为记忆T细胞（memory T cell,Tm）为CD45RO+细胞群。特性特性TnTmCD45CD45RACD45RO归巢受休表归巢受休表达达高水平高水平低水平低水平粘附分子表粘附分子表达达低水平低水平高水平高水平再循环再循环血流血流淋巴组织淋巴组

9、织直接移行至抗原部位直接移行至抗原部位寿命寿命短（数日）短（数日）长（数月）长（数月）再次抗原刺再次抗原刺激激-+T细胞的分类细胞的分类 记忆T细胞（memory T cell,Tm）根据其表面受体CCR7分子的表达和功能不同，可分为TEM（CCR7-）和TCM （CCR7+）细胞。钾通道钾通道Kv1.3 和和 IKCa1在不同在不同T细胞中的表达细胞中的表达钾离子通道钾离子通道2003年诺贝尔奖年诺贝尔奖钾离子通道是一类细胞膜上选择性允许K+跨膜通过的离子通道，是继G-蛋白偶联受体和蛋白激酶之后的第三大信号转导分子家族。治疗自身免疫疾病的新靶标：钾通道治疗自身免疫疾病的新靶标：钾通道钾通道结

10、构示意图钾通道结构示意图 TEM细胞的异常增殖在自身免疫疾病中起重要的作用，钾通道成为了治疗自身免疫疾病的一个新的药物靶标。 治疗自身免疫性疾病的新靶标：通道治疗自身免疫性疾病的新靶标：通道 靶向通道的先导药物研发靶向通道的先导药物研发 靶向先导药物在预防和治疗自身免疫疾病靶向先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用中的应用 有机小分子调有机小分子调节剂的筛选与节剂的筛选与设计设计靶向钾通道的药物靶向钾通道的药物研发研发多肽调节剂的多肽调节剂的筛选与设计筛选与设计有机小分子调节剂的筛选与设计有机小分子调节剂的筛选与设计 1998年，Merck公司就分离到correolide，它能在100nM水

11、平上抑制T细胞的增殖。随后Merck、Pfzer等研发机构分离、合成、和功能鉴定了10多种有机小分子药物候选物。 有机小分子先导药物的不足：作用于钾通道的选择性和特异性不强有机小分子的药理学活性有机小分子的药理学活性有机小分子调节剂的筛选与设计有机小分子调节剂的筛选与设计多肽调节剂的筛选与设计多肽调节剂的筛选与设计 自然界中的有毒动物自然界中的有毒动物 多肽药物的多肽药物的筛选与设计筛选与设计 以蝎毒肽为基础的多以蝎毒肽为基础的多肽药物筛选与设计肽药物筛选与设计 以海葵毒素为基础的以海葵毒素为基础的多肽药物筛选与设计多肽药物筛选与设计 海葵毒素多肽药物的研发海葵毒素多肽药物的研发选择性较好的选

12、择性较好的SL5多肽药理学活性多肽药理学活性海葵毒素海葵毒素Shk海海葵葵多肽调节剂的筛选与设计多肽调节剂的筛选与设计 自然界中的有毒动物自然界中的有毒动物 多肽药物的多肽药物的筛选与设计筛选与设计 以蝎毒肽为基础的以蝎毒肽为基础的多肽药物筛选与设计多肽药物筛选与设计 以海葵毒素为基础的以海葵毒素为基础的多肽药物筛选与设计多肽药物筛选与设计 以蝎毒肽为基础的药物研发以蝎毒肽为基础的药物研发 作为天然的毒素资源库，蝎毒肽比海葵毒素更丰富。蝎蝎作用于钾离子通道的蝎毒肽作用于钾离子通道的蝎毒肽如何获得对钾通道高选择性和特异性的多肽调节剂？ 从蝎毒肽中天然分离 以蝎毒肽为模板进行设计和改造天然的蝎毒肽

13、包含多种作用于通道的成员，但选择性和特异性普遍不高。天然的蝎毒肽包含多种作用于通道的成员，但选择性和特异性普遍不高。ImKTx88的筛选和序列分析从海南斑等蝎（从海南斑等蝎（Isometrus maculates）毒腺组织）毒腺组织cDNA文库中筛选出钾通道蝎毒肽文库中筛选出钾通道蝎毒肽ImKTx88基因。基因。天然蝎毒肽调节剂的筛选天然蝎毒肽调节剂的筛选多肽多肽ImKTx88的表达纯化和质谱鉴定的表达纯化和质谱鉴定 2005年，法国科学家Jean-Marc等改造蝎钾毒素多肽OSK1获得了特异作用于通道的多肽AOSK1。以蝎毒肽为模板的多肽调节剂设计和改造以蝎毒肽为模板的多肽调节剂设计和改造A

14、OSK1及其突变体对的特异性和选择性比较及其突变体对的特异性和选择性比较 2008年，武汉大学依据已建立的年，武汉大学依据已建立的多种蝎毒腺多种蝎毒腺cDNA文库，结合蝎文库，结合蝎毒肽的结构与功能研究，设计筛毒肽的结构与功能研究，设计筛选选获得了获得了选择性和选择性和特异特异性。性。靶向钾通道先导药物多肽靶向钾通道先导药物多肽ADWX-1的筛选的筛选 -KTx3亚家族蝎毒肽序列比对亚家族蝎毒肽序列比对BmKTX结构结构蝎毒肽和钾通道作用模式蝎毒肽和钾通道作用模式先导药物多肽先导药物多肽ADWX-1的设计的设计先导药物多肽先导药物多肽ADWX-1的设计的设计ADWX-1和和BmKTX的序列比对

15、及其和通道作用的序列比对及其和通道作用ADWX-1和和rBmKTX的圆二色谱比较的圆二色谱比较 ADWX-1和和BmKTX的的NMR结构比较结构比较ADWX-1多肽的表达纯化多肽的表达纯化PeptideChannels and cellstestedKd-IC50 xm (nM)Specificity Index xm/cnn=Kv1.3CharybdotoxinhKv1.3 TlymphrKv1.1 oocyterKv1.2 B823.59991011002.9KaliotoxinrKv1.3 oocytemKv1.1 oocytemKv1.2 oocyte0.411.12512.761OS

16、K1P12,K16,D20mKv1.3mKv1.1 COShKv1.2 COS0.0593.181001541000AnuroctoxinhKv1.3 TlymphhKv1.1 L929hKv1.2 COS0.731006.111008.34ShK(L5)hKv1.3 TlymphmKv1.1rKv1.2 B820.0767.048192100ADWX-1mKv1.3 HEKmKv1.1 HEKhKv1.2 HEK0.0020.651001300100000ADWX-1与通道作用的机制？与通道作用的机制？ 设计设计ADWX-1的丙氨酸扫描突变体的丙氨酸扫描突变体 测定突变体的药理学活性测定突变

17、体的药理学活性 生物信息学模建复合物结构生物信息学模建复合物结构ADWX-1的突变体设计的突变体设计ADWX-1突变体二级结构分析突变体二级结构分析突变体对通道的药理学活性突变体对通道的药理学活性 ADWX-1 mutant IC50 (pM)nIC50(mut)/ IC50(wt)Wild type1.890.53131.0R11A336.349.18177.9R23A7344.2395043885.8F24A4013.485742123.4K26A967.47264511.8T28A58.26.5430.8N29A454.440.76240.4H33A77.237.4340.8T35A28

18、.019.2414.8复合物结构复合物结构ADWX-1突变体计算机丙氨酸突变体计算机丙氨酸扫描结果和实验结果的比较扫描结果和实验结果的比较ADWX-1与通道作用的分子机制与通道作用的分子机制 ADWX-1与通道作用的分子机制与通道作用的分子机制 在ADWX-1和通道的相互作用中， ADWX-1 中的Arg23， Phe24 和Lys26是最重要的功能氨基酸残基。Arg23，Lys26和的相互作用和的相互作用Phe24和的相互作用和的相互作用Arg23， Phe24 ，Lys26和的相互作用和的相互作用有机小分子和多肽调节剂的比较有机小分子和多肽调节剂的比较有机小分子有机小分子correolid

19、e与通道的相互作用与通道的相互作用多肽多肽KTX与通道的相互作用与通道的相互作用通道序列比对、通道模型及药通道序列比对、通道模型及药物分子作用区域示意图物分子作用区域示意图 小分子和多肽作用小分子和多肽作用通道的示意图通道的示意图 与有机小分子药物相比，多肽调节剂具有更好的选择性和特异性。细胞内细胞内小分子小分子多肽多肽钾钾通通道道 治疗自身免疫性疾病的新靶标：通道治疗自身免疫性疾病的新靶标：通道 靶向通道的先导药物研发靶向通道的先导药物研发 靶向先导药物在预防和治疗自身免疫疾病靶向先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用中的应用 靶向钾通道的药物研发靶向钾通道的药物研发疾病疾病动物模型动物模

20、型治疗药物治疗药物药物类型药物类型药物有效剂量药物有效剂量类风湿性关节炎类风湿性关节炎大鼠大鼠PIAPIA模型模型SL5SL5多肽多肽100ug/kg100ug/kgI-I-型糖尿病型糖尿病MHC IIMHC II限制型限制型DP-BB/WDP-BB/W大鼠大鼠模型模型PAP-1PAP-1小分子小分子50mg/kg50mg/kg过敏性皮炎过敏性皮炎大鼠大鼠ACDACD模型模型PAP-1PAP-1/ShK/ShK小分子小分子/ /多肽多肽10mg/kg 10mg/kg /16ug/kg/16ug/kg多发性硬化症多发性硬化症实验性自身免实验性自身免疫脑脊髓炎大疫脑脊髓炎大鼠模型鼠模型ShKShK

21、，ShK-ShK-Dap32Dap32多肽多肽16ug-80ug/kg16ug-80ug/kg先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用 靶向通道治疗多发性硬化症靶向通道治疗多发性硬化症靶向通道治疗靶向通道治疗I-型糖尿病型糖尿病靶向通道治疗类风湿性关节炎靶向通道治疗类风湿性关节炎靶向通道治疗多发性硬化症靶向通道治疗多发性硬化症临床病例证实多发性硬化症（MS）病人中经髓鞘质抗原激活的T细胞为特异性表达高数量通道的表型。MS病人中激活的TEM细胞显著增加，其中TEM细胞高表达通道。CD8+的效应记忆的效应记忆T细胞激活后也高表达钾通道细胞激活后也高表达钾通道通道的阻断剂多肽通道的阻断剂多肽ShK可选择性抑制可选择性抑制MBP特异性的特异性的TEM细胞增殖细胞增殖通道阻断剂多肽通道阻断剂多肽KTX抑制抑制MBP诱导的诱导的T细胞增殖和激活细胞增殖和激活MS病人的脑组织炎症细胞中特异性高病人的脑组织炎症细胞中特异性高表达通道表达通道MS病人脑脊液细胞（CSF）在体外激活后，迅速转变为TEM细胞；而正常人脑脊液细胞和外周血细胞（PB）激活后维持表型不变。通道阻断剂对通道阻断剂对MS的预防和治疗的预防和治疗通道阻断剂多肽KTX、ShK和ShK-L5可有效预防和治疗MS的动物模