生物素亲与素系统有关技术课件

1、生物素亲与素系统有关技术课件生物素生物素-亲和素系统简单介绍亲和素系统简单介绍BAS基本类型和反应原理基本类型和反应原理生物素和亲和素放大系统的应用生物素和亲和素放大系统的应用对不起，哥是重点！对不起，哥是重点！了解了解了解了解一一) 生物素及活化生物素生物素及活化生物素二二) 亲和素及链霉亲和素亲和素及链霉亲和素三三) 生物素生物素-亲和素系统的特点亲和素系统的特点(一一)生物素生物素1 概念：概念： 生物素生物素(biotin)是动、植物体内广泛分是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素或维生素H。2.分子式：分子式： C10H16O3

2、N2S 分子量：分子量：3.结构：结构： （CH2）4COOH 结合亲和素结合亲和素结合蛋白质结合蛋白质咪唑酮环咪唑酮环噻吩环噻吩环whywhywhy为什么为什么要对生物素要对生物素进行活化？进行活化？为什么为什么要对生物素要对生物素进行活化？进行活化？我我是是生生物物素素我我可可以以是是抗抗体，体，也也可可以以是是酶酶我是亲和素，我来了我是亲和素，我来了Broken Heart我是亲和素，我来了我是亲和素，我来了 1）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由于大分子蛋白质的空间位阻效应，可影响生物于大分子蛋白质的空间位阻效应，可影响生物素与亲和素间的结合；素与亲

3、和素间的结合； 2）生物素只能依靠肽键与蛋白质上的氨基）生物素只能依靠肽键与蛋白质上的氨基结合。结合。 因此，活化生物素可克服以上缺点，既减少因此，活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻效应，又可扩大其结合的对象。空间位阻效应，又可扩大其结合的对象。(二二)活化生物素活化生物素l1.标记蛋白质氨基氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。 l2.标记蛋白质醛基醛基：酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）。 l3.标记蛋白质巯基巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。 l4.标记核酸核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。 l1.标

4、记蛋白质氨基氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。 抗体中性和偏碱性蛋白的标记l2.标记蛋白质醛基醛基：生物素酰肼（BHZ）、肼化生物胞素（BCHZ） 用于偏酸性糖蛋白的生物素标记l标记对象： 大分子活性物质：如抗原、抗体。标记后不影响免疫活性。 酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。会降低ALP的活性。(三)生物素标记蛋白质l活化生物素可与不同的大分子物质结合，应根据可标记基团的种类及特性，选择相应的活化生物素； 抗体：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素l一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，即生物素化大分子具有多价性多价性，它是BAS多级放大作用的物

5、质基础。l但每个蛋白质上标记的生物素分子数量应控制在一定范围。 每个抗原标记1-3个生物素分子为宜； 每个抗体标记3-5个生物素分子为宜； 生物素：IgG(mg/mg)=2:1，效果较好。一一) 生物素及活化生物素生物素及活化生物素二二) 亲和素及链霉亲和素亲和素及链霉亲和素三三) 生物素生物素-亲和素系统的特点亲和素系统的特点l(一) 亲和素(avidin，A) 1.概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳 水化物的碱性糖蛋白碱性糖蛋白。 2.分子量：68 0003.结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸色氨酸，它是与生物素结合的基团。A4.特性：每个亚基都可结合1个生物素分子，即

6、1个亲和素分子可结合4个生物素分子。5.亲和常数：1015/mol6.缺点：由于是碱性蛋白（PI=10），且含含糖基糖基，与聚苯乙烯的非特异性吸附非特异性吸附较高，会导致本底增大，降低检测灵敏度。l(二)链霉亲和素(streptavidin，SA) ：1.概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质。2.分子量：65 0003.结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙氨酸含量较大 。4.特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分子。5.亲和常数：1018/mol6.优点：为弱酸性蛋白（），不含糖基不含糖基，因此与聚苯乙稀的非特异性吸附非特异性吸附远低于亲和素，因此应用广泛。SAl标记对象： 大分子

7、物质：如酶、抗原和抗体。 小分子物质：胶体金、FITC和化学发光物等。二）亲和素和链霉亲和素(三 ) 亲和素的标记 一一) 生物素及活化生物素生物素及活化生物素二二) 亲和素及链霉亲和素亲和素及链霉亲和素三三) 生物素生物素-亲和素系统的特点亲和素系统的特点1.特异性强： 亲和素和生物素间的高亲和力。2.灵敏度高： 每个亲和素分子可与四个生物素结合； 生物素化大分子具多价性。3.快速、稳定：4.应用广泛： 可与酶、荧光素、胶体金等多类标记技术结合； 可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、间接法、竞争法等，在此基础上引入A-B系统。lBAB法：lBA法：lABC法：二、二、 BAS的基本类型

8、及原理的基本类型及原理lBAB法： AbB A AbB-A B AbB-A-B 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E；AbB和A-B的两次放大效应，可提高灵敏度。 +A+A+BAB法在夹心法在夹心ELISA中的应用中的应用lBA法： AbB A AbB-A 特点：省略加标记生物素步骤，操作较BAB法简便；AbB的放大效应，该法有相当高的灵敏度。+A-EBA法在间接法在间接ELISA中的应用中的应用lABC法： A+B A- B -ABC Ag+AbB Ag-AbB ABC Ag-AbB-ABC 特点：是在BAB法基础上的改良，将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC；操作比BAB法

9、简便，但仍然保持较高的灵敏度。+ABCB-E + A ABCABC法在夹心法在夹心ELISA中的应用中的应用l1、BAS在酶免疫技术中的应用l2、BAS在荧光免疫技术中的应用l3、BAS在放射免疫技术中的应用l4、 BAS在分子生物学中的应用 免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增扩增代替ELISA的酶催化底物显色。 PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。 一、主要程序一、主要程序1. 抗原+生物素化抗体抗

10、原-生物素化抗体复合物； 2. 加亲合素抗原-生物素化抗体-亲合素复合物； 3. 加生物素化DNA抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA； 4. PCR扩增生物素化DNA部分。 l免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的还不多； l实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。 A Monoclonal-AntibodyEnzymeImmunoassayfor Detection of HepatitisB Surface Antigen with Use of a Biotin-Avidin SystemCLINICAL CHEMISTRY, 1985,31(2):202-205Definition of Three Serotypes of Hantaviruses by a Dou