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文档简介

1、 使蛋白质或脂类等菌体成分变性 基因组DNA产生缺刻，变成线状，并解离成单链（变性） 由于质粒DNA较小，仍为环状变性区虽大，但不分离 中和或恢复至室温中和或恢复至室温 变性的质粒DNA按原互补配对结构复性 基因组DNA随机复性，与蛋白质等菌体成分结合在一起离心分离离心分离 质粒DNA存在于上清中，回收 苯酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀纯化纯化1、取1.0ml培养液倒入1.5ml EP管中,4下6000g离心2min。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽，使细胞沉淀尽可能干燥。 3、菌体沉淀重悬浮于200l溶液中(需剧烈振荡,充分摇匀)。 4、加入新配制的400l溶液(新鲜配置：

2、 0.4M NaOH和2%SDS 储液各取等体积混匀后加入), 盖紧管口，温和颠倒离心管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴3分钟。 5、加入300l预冷的溶液,盖紧管口，温和颠倒离心管振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心5-10分钟。 四、操作步骤四、操作步骤 q对数期菌体对数期菌体溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重悬充分重悬溶液溶液IIII裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液 使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加） 培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢

3、失 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失） 菌体量适当。 培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。 变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。 复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。 对于细胞壁较厚的菌（如酵母菌）质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 （TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase；pH值为8.0，可防止DN

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