实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定

1、实验1-3 溶菌酶的提取分离及鉴定（酶活力、纯度及分子量测定）1实验内容1. 溶菌酶的粗提取2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定2背景知识溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。生物学效应：主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+以及N-乙酰葡

2、萄糖胺所抑制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活345溶菌酶理化性质：溶菌酶理化性质：相对分子质量相对分子质量14700 Da，由，由129个个氨基酸氨基酸残基构残基构，pI:10.8，最适温度为，最适温度为50，最适，最适pH为为67左右。左右。280nm的消光系数的消光系数为为13.06背景知识：背景知识：酶的提取、分离纯化酶的提取、分离纯化l初步纯化初步纯化（rough fractionation） （提取）：（提取）：把酶从生把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。能多的酶，尽量

3、少的杂质从原料中引入溶液。 l高度纯化高度纯化（fine fractionation） （精纯化）：除去与（精纯化）：除去与产物性质相似的杂质。产物性质相似的杂质。l纯化方案评价纯化方案评价：酶活力酶活力、蛋白浓度蛋白浓度、纯度纯度7 粗纯化（粗纯化（ 提取）目标：提取）目标： a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。l注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（010）操作。提取原则提取原则a. 相似相溶。b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。8离心分离离心分离（一）一）基本原理基本原理1. 1. 离心力离心力 Fc = m ac m r r 2 2 m r

4、r （2 N/60）2 2 N为离心机为离心机每分钟转数每分钟转数 （r/min ）； Fc通常以相对离心力通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表）表示，示，即离心力即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少）的多少倍倍。一般用一般用g g（或数字（或数字 g g）表示。）表示。RCF = RCF = m r r （2 N/60）2 2 /mg= 1.12 = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系此公式描述了相对离心力与转速之间的关系 旋转半径用旋转半径用r r平均平均

5、代替代替 r r平均平均=1/2=1/2（r r大大+r+r小小）cmcm 9 通常：通常：低速离心以低速离心以每分钟的转数每分钟的转数表示，如：表示，如：4000r/min4000r/min。高速离心（超速），常以高速离心（超速），常以相对离心力相对离心力（RCFRCF）表）表 示，如：示，如：65000g65000g。 两者可换算或查测算图。两者可换算或查测算图。10名称名称 转速转速(r/min)(r/min) 注意事项注意事项 低速离心机低速离心机 60006000 常温，注意样品热变性和离心常温，注意样品热变性和离心管平衡管平衡 高速离心机高速离心机 6000 25000冷冻（防止温

6、度升高），冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 超速离心机超速离心机 25000冷冻真空系统（减少空气阻冷冻真空系统（减少空气阻力和摩擦），力和摩擦），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 离心机的种类离心机的种类 11l角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。 l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 12l角式离心头要配套，低温使用要预冷，操角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。作注意稳、盖、旋紧。13l材质：玻璃，材质：玻璃，塑料塑料l强度：和离强度：和离心速度相配心速度相配l大小：和转大小：和转子配套子配套

7、l高速超速管高速超速管要加盖要加盖14l平衡、定温、定速、定时。平衡、定温、定速、定时。15实验一、实验一、 溶菌酶的粗提取溶菌酶的粗提取略略16u 酶精纯化常用技术l膜分离技术l柱层析技术l蛋白质结晶透析超滤凝胶过滤（分子筛/排阻）层析离子交换层析疏水层析吸附层析亲和层析反相层析17GelFiltrationIonExchangeHydrophobic InteractionAffinity Reversed Phase实验二、溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定目的：1. 掌握离子交换层析原理及层析操作所需的必须原件。2. 掌握层析柱填装方法及层析填料的保存3. 掌握比色法测定溶菌酶的浓

8、度与酶活18l原理：l 根据溶菌酶 pI 10.8，pH 8.0 PBS 中携带？电，与阴/阳离子层析填料可结合，通过吸附后，提高pH或离子强度将溶菌酶与其他蛋白进行分离达到纯化目的。l溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的酶解作用导致细菌完整性破坏，OD600值会下降，通过单位时间内（每分钟）OD600值的下降评价酶活性。l溶菌酶的活力单位（U）：在室温，pH8.0的条件下，OD600每分钟降低0.001为1个活力单位。l280nm的消光系数为13.0，根据 A=ECL 可粗略测定溶菌酶浓度，用于酶比活的评价。1920离子交换层析离子交换层析 （ion exchange chromatography，

9、IEC）212.离子交换填料离子交换填料： 离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。 纤维素纤维素 琼脂糖琼脂糖 葡聚糖葡聚糖 载体载体 电荷基团电荷基团 O OCHCH2 2COOCOO- -NaNa+ +反离子反离子1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。22离子交换剂离子交换剂-带有电荷基团的带有电荷基团的不溶性不溶性载体载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-载体载体Diethylaminoethyl(DEAE) 阴离子交换剂阴离子交换剂(可吸附可吸附带负电的蛋白质带负电的蛋白质) 阳离子交换剂阳离子交换剂(可吸附

10、可吸附带正电的蛋白质带正电的蛋白质)23l阴离子交换剂：阴离子交换剂：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基羟丙基l阳离子交换剂：阳离子交换剂：l常用羧甲基常用羧甲基 CM CH2COO l磺丙基磺丙基 SP C3H6SO3DEAE C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH324 化学原料合成化学原料合成 ： sephadex sepharose 载体载体 天然材料制成：天然材料制成： cellulosecellulose 如：如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose25 实验设计原实验设计原理理

11、 利用不同的蛋白利用不同的蛋白质质分子在溶液中所分子在溶液中所带电带电荷荷不同，因而不同，因而与离子交换剂与离子交换剂有不同吸附力有不同吸附力而而分离。分离。pH8.0pI 8.0 蛋白蛋白质带质带正正电电pI 8.0 蛋白蛋白质带负电质带负电溶菌酶溶菌酶pI:10.8262. 阴离子交换剂分离蛋白质阴离子交换剂分离蛋白质的的过程过程平衡平衡吸附吸附去吸附去吸附分离结束分离结束再生再生+低盐低盐高盐高盐利用不同利用不同盐浓度将盐浓度将不同蛋白不同蛋白质质洗洗脱下脱下來來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-273

12、. 操作操作 平衡平衡 上样上样 冲洗冲洗 洗脱洗脱 再生再生1）上样：）上样：上样体积不十分严格。上样体积不十分严格。2）洗脱）洗脱: 增加溶液的离子强度增加溶液的离子强度 梯度洗脱法梯度洗脱法 （连续、不连续）（连续、不连续）改变溶液的改变溶液的pH值值 3）再生：）再生：0.5-1mol/L NaCl溶液处理。溶液处理。4.4.应用应用 制备纯化生物大分子制备纯化生物大分子28梯度洗脱方式29图图4-39 梯度溶液的制备方法和洗脱曲线梯度溶液的制备方法和洗脱曲线（a）线性梯度；（）线性梯度；（b）凸形梯度；（）凸形梯度；（c）凹形梯度；（）凹形梯度；（d）编程梯度）编程梯度30 层析柱的

13、制备与层析操作层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备柱层析的设备: 层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。部分收集器、梯度洗脱器。31l层析装置：层析装置：l 梯度混和器梯度混和器l 蠕动泵蠕动泵l 层析柱层析柱l 监测仪监测仪l 记录仪记录仪l 收集器收集器 32现代化层析设备AKTA层析柱层析柱XKBPG实验2.1 层析柱的填装l1.观摩l2.实验步骤l1）测定酶浓度（S-2）lC(mg/ml)=A280/13l2）若填料载量为20mg/ml，计算拟纯化100mg 蛋白需要的填料量和量取量。34l3）装柱要点：la. 用纯水将乙醇保存液置

14、换lb. 柱头及柱底适配器确保无气泡，可用注射器推注赶气泡，并确保连接管路密闭无泄漏。lc. 填料倾倒入柱管内前先加入少量水覆盖柱底ld. 柱拆卸后填料务必回收，并保存于20%乙醇中。35二、酶的活力单位及酶活测定：二、酶的活力单位及酶活测定：1. 1. 酶活单位：酶活单位：19611961年国际生化协会酶学委员会统一规年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（定，酶的国际单位（IUIU）规定为：在最适反应条件（温度）规定为：在最适反应条件（温度2525）下，每分钟内催化）下，每分钟内催化1 1微摩尔（微摩尔（molmol）底物转化为产物）底物转化为产物所需的酶量（或所需的酶量（或1 1

15、分钟内转化底物生成分钟内转化底物生成1 1微摩尔产物的酶量）微摩尔产物的酶量）称为称为1 1标准单位标准单位。 372.2.酶的比活力：酶的比活力： 每单位酶蛋白所含的活力单位数。每单位酶蛋白所含的活力单位数。 对对固体酶固体酶：用活力单位：用活力单位/mg/mg酶蛋白、或活力单酶蛋白、或活力单位位/mg/mg酶蛋白氮来表示；酶蛋白氮来表示； 对对液体酶液体酶：用活力单位：用活力单位/ml/ml酶液来表示。酶液来表示。 很明显，比活力越大，酶的活力越大。很明显，比活力越大，酶的活力越大。分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的

16、能力可采用此法。或产物有紫外吸收的能力可采用此法。测压法：产物中有气体，测气压增加量。测压法：产物中有气体，测气压增加量。滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂 反应生成荧光产物可用此法。反应生成荧光产物可用此法。旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。 除了以上方法外，还可根据除了以上方法外，还可根据产物的性质产物的性质采用其它方法。采用其它方法。 3.具体测定方法具体测定方法4. 回收率和纯化倍数回收率和纯化倍数回收率回收率 100提纯后酶总

17、活力提纯后酶总活力提纯前酶总活力提纯前酶总活力纯化倍数纯化倍数每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力40实验实验2.2溶菌酶的活性测定溶菌酶的活性测定实验材料：实验材料：1. 枯草芽孢杆菌悬液枯草芽孢杆菌悬液2. S1，S23. PBS等等4. 分光光度计、比色皿、计时器、离心机等分光光度计、比色皿、计时器、离心机等41实验步骤：实验步骤：1. 取取6ml 菌悬液，菌悬液，3500rpm*5min，弃上清，沉淀，弃上清，沉淀 6ml PBS重悬。重悬。2. 测定测定OD600并记录（吸光度并记录（吸光度0.51.0，若读数过高可适当稀释），若读数过高可适当稀释）3. 测定样品准备（酶液务

18、必在仪器等条件准备好，临测定前加测定样品准备（酶液务必在仪器等条件准备好，临测定前加入）入）比色皿1234PBS缓冲液/ml5-细胞PBS悬液/ml-54.84.8酶液S1/ml-0.2酶液S2/ml0.242实验步骤：实验步骤：4. 酶活性测定，以管（酶活性测定，以管（PBS）为对照，每隔）为对照，每隔30s 测定测定2,3,4管的管的OD600并记录并记录5. 酶活力及比活性计算：酶活力及比活性计算：U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2C(mg/ml)=A280/136. 纯化回收率及纯化倍数计算纯化回收率及纯化倍数计算时间（s）03060901201501802号 3

19、号 4号 回收率回收率 100US2*V2US1*V1纯化倍数纯化倍数S2比活力比活力S1比活力比活力43样品体积ml蛋白浓度mg/ml总蛋白 mg活力 u/ml比活力 u/mg总活力 U回 收 率%提 纯 倍数 S1V1 1001S2V2 7. 完成下表完成下表44实验实验3溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定实验目的实验目的:1、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶（烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据；）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据；2、掌握电泳原理以及、掌握电泳原理

20、以及SDS-PAGE垂直板电泳垂直板电泳分析分析蛋白质技术；蛋白质技术；3、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法，、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法，SDS-PAGE分子量测定分子量测定图谱的绘制与计算；图谱的绘制与计算；4、了解在电泳中分子量标准物的使用。、了解在电泳中分子量标准物的使用。45SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称）简称SDS PAG

21、E。 用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass, Mrrelative molecular mass, Mr）测定。）测定。1.1.原理原理461.1.原理原理 SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDSSDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变

22、，使蛋白破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质质SDSSDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm1.8nm），长轴与蛋），长轴与蛋白质分子量成正比。白质分子量成正比。 因此，因此，蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。（蛋白质分子量）有关。47 SDS-PAGE separates proteins by MW48 49502. 分离效应分离效应 连续电泳

23、（连续电泳（continuous electrophoresis） 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（不连续电泳（discontinuous electrophoresis） 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应电荷效应不连续不连续PAGE PAGE 分子筛效应分子筛效应 浓缩效应浓缩效应 连续连续PAGEPAGE 凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。径的分离胶。l浓缩效应：使样品

24、在浓缩胶中被浓缩成一条窄浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。带，然后再进入分离胶进行分离。l电荷效应电荷效应 : 分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。迁移率不同。l分子筛效应分子筛效应 ：大小和形状不同的样品分子通大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。表现出不同的迁移率。 522. 实验步骤：实验步骤：（SDS-PAGE）1）母液配制）母液配制2）制胶准备制胶准备: 玻璃板清洗、干燥玻璃板清洗、干燥 制胶架的准备：严格按说明书组装制胶

25、架制胶架的准备：严格按说明书组装制胶架。532. 实验步骤：实验步骤：（SDS-PAGE）3）制胶制胶: 分离胶、浓缩胶：根据待分离样品的分子大小选择分离胶、浓缩胶：根据待分离样品的分子大小选择15%的分离胶，如表配制的分离胶，如表配制54浓缩胶（10 ml）双蒸水0.5 mol/L pH 6.8Tris-HCl30%胶贮液10% SDSTEMED10% AP5%3.4ml0.63 ml0.83ml50 l5 l50 l分离胶（20 ml）双蒸水1.5 mol/L pH 8.8Tris-HCl胶贮液10% SDS TEMED10% AP12%3.3ml2.8ml2.5 ml2.0ml4 ml5

26、 ml100 l4 l100 l553、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右，左右，之后加少许蒸馏水，静置之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程分钟。凝胶配制过程要迅速要迅速，催化剂，催化剂TEMED要在注胶前再加入要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。界面。4、

27、倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，、倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘5 mm处，迅速插入样梳，静置处，迅速插入样梳，静置10分钟。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。分钟。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。5、电泳液缓冲（、电泳液缓冲（*10）配制：）配制：30g Tris, 150g Gly, 10g SDS+800ml dH2O, 定容至定容至1000ml565、样品处理：取、样品处理：取30ul样品（样品（S1，S2），加入），加入30ul 上样缓冲液，上样缓冲液，100水浴水浴30min，拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，使锯齿孔内的气泡全部排出拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。，否则会影响加样效果。6、加样、加样3个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白加入相应体积的样品和蛋白Marker。其中蛋清（。其中蛋清（S1）和）和Marker加样加样量为量为2 l，S1、S2、S3、和、和S4加样量