生物化学古练权版

1、.非水溶剂中的酶促反应 有机介质中的酶促反应概述 有机介质中反应的条件 有机介质对酶性质的影响 有机介质中酶催化的应用.长期的观点认为长期的观点认为:有机溶剂是酶的变性剂、失活剂这一传统酶有机溶剂是酶的变性剂、失活剂这一传统酶学思想的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究此前几乎毫学思想的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究此前几乎毫无进展。这一观点直到无进展。这一观点直到1984年，非水溶剂中酶催化的研究才年，非水溶剂中酶催化的研究才取得了突破性的进展。取得了突破性的进展。1984年美国年美国Klibanov, A.M.在在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的上发表了一

2、篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述。综述。Klibanov等的工作等的工作在仅含微量水的有机介质在仅含微量水的有机介质(Microaqueous media)中成功地酶促合成了酯、肽、手性中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。基于研究工作，醇等许多有机化合物。基于研究工作，libanov等提出只要等提出只要条件合适，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天条件合适，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，酶不仅可以在水与有机溶剂互然的疏水性底物和产物的转化，酶不仅可以在水与有机溶剂互溶体系，也可以在水与有机溶剂组成的双液相体系，甚至在仅溶体

3、系，也可以在水与有机溶剂组成的双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。这一观点含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。这一观点无疑是对酶只能在水溶液中起作用传统酶学思想的挑战无疑是对酶只能在水溶液中起作用传统酶学思想的挑战有机介质中的酶促反应概述.有机相酶反应的优点 有利于疏水性底物的反应。 可提高酶的热稳定性。 能催化在水中不能进行的反应。 可改变反应平衡移动方向。 可控制底物专一性。 可防止由水引起的副反应。 可扩大反应pH值的适应性。 酶易于实现固定化。 酶和产物易于回收。 可避免微生物污染。.有机相酶反应具备条件 保证必需水含量。 选择合适的酶及酶形式。

4、 选择合适的溶剂及反应体系。 选择最佳pH值。.有机相酶反应的研究进展 超临界流体中的酶反应 仿水溶剂和印迹技术.超临界流体中的酶反应 指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力；然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。.超临界流体的有关性质 超临界流体的P-V-T性质. 所谓超临界CO2是指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1，临界压力7.28Mpa)时的状态。该流体具有无毒、无臭、不燃等优点。 提高溶剂选择性的基本原则 操作温度和超临界流体的临界温度接近 超临界流体的化学选择和待分离溶质的化学性质接近超临界流体的有关性质.超临界

5、流体萃取的应用实例.有机相酶反应的研究进展 超临界流体中的酶反应 仿水溶剂和印迹技术.仿水溶剂和印迹技术 仿水溶剂体系原理 分子印迹技术.仿水溶剂体系原理 可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。 极性添加剂对体系的影响 对反应体系内水的分配影响 与蛋白质的直接作用 对产物分配的影响 应用举例：通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。.分子印迹技术 当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后

6、，再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。 原理： 竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。 酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功能。.非水溶剂中的酶促反应 有机介质中的酶促反应概述 有机介质中反应的条件 有机介质对酶性质的影响 有机介质中酶催化的应用.有机介质中酶促反应的条件有机介质中酶促反应的条件 必需水 酶的选择 溶剂及反应体系的选择 pH选择和离子强度的影响.1.必需水 概念概念 紧紧吸附

7、在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。少量水。.1.必需水 影响酶反应体系中需水含量的因素不同酶需水量不同。同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同，溶剂疏水性越强，需水量越少.2.2.酶的选择酶的选择 酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。除与酶有关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系有关。 酶形式的选择 酶粉 例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。 化学修饰酶 例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、pH、蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。 固定化

8、酶 把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。.3.溶剂及反应体系的选择 水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等 水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等 酶促反应有机介质体系： 单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂） 两相体系（水/水不溶性有机溶剂） 低水有机溶剂体系（有机溶剂体系） 反胶束体系.反胶束体系概念和表面活性剂 反胶束体系概念 表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳定的系统。 表面活性剂：表面活性剂是由亲

9、水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。.有机溶剂影响酶催化的方式有机溶剂影响酶催化的方式 有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活 增大酶反应的活化能来降低酶反应速度。 降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降。 酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。 有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活 有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用.4.4.pHpH选择和离子强度的影响选择和离子强度的影响 pH选择：在有机溶剂的环境中，不会发生

10、质子化及脱质子化的现象。酶在水相的pH值可在有机相中保持，同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不相同。 离子强度影响：随冻干时用的缓冲溶液离子强度增大，酶活会增大。.非水溶剂中的酶促反应 有机介质中的酶促反应概述 有机介质中反应的条件 有机介质对酶性质的影响 有机介质中酶催化的应用.有机介质对酶性质的影响有机介质对酶性质的影响 稳定性 活性 专一性 反应平衡方向.1.1.稳定性稳定性l 热稳定性提高热稳定性提高和和储存稳定性提高储存稳定性提高l 结论：在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切结论：在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量

11、超相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。.2 2. .活性活性 刚刚-柔并存柔并存 刚性：生物大分子结构的精确性刚性：生物大分子结构的精确性 柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。 （1）单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响）单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响 有机溶剂直接作用于酶。有机溶剂直接作用于酶。 有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）达

12、到最大值；若浓度再升高，则活性下降。（最适浓度）达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。 （2）低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但）低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦变化。也有某些酶活性亦变化。 例例 有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水活度下的酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而变化，在一水活度下的酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而变化，在一定水活度下，酶活性随载体不同而变化。定水活度下，酶活性随载体不同而变化。.2 2. .活性活性 （3）在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加

13、）在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加 超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（性（Super-activity）。）。 认为：认为： 超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性所引起。所引起。 根据根据 ： 微团水化程度（微团水化程度（W）（）（W=H2O/表面活性剂表面活性剂）的最佳值和酶）的最佳值和酶活性的最大值呈正相关活性的最大值呈正相关 W值最佳时，微团内径总是相当于被包裹的酶分子直径值最佳时，微团内径总是相当于被包裹的酶分子直径.3.专一性专一

14、性 某些有机介质可能使某些酶的专一性发生某些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结果。果。 有些在水中不能实现的反应途径，在有机有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。介质中却成为主导反应。.酶活性丧失的可能原因酶活性丧失的可能原因.4.4.反应平衡方向反应平衡方向.非水溶剂中的酶促反应 有机介质中的酶促反应概述 有机介质中反应的条件 有机介质对酶性质的影响 有机介质中酶催化的应用.有机介质中酶催化的应用有机介质中酶催化的应用.手性药物的拆分概念： 手性化合物是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体

15、化合物。 手性药物两种对映体的药效差异 一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效 一种有显著疗效，另一种有毒副作用 两种对映体的药效相反 两种对映体具有各自不同的药效 两种消旋体的作用具有互补性.手性药物的拆分方法分为：非生物法、生物法非生物法（机械分离法、形成和分离对映体异构法、色谱分离法、动力学拆分）生物拆分法原理 实质即两个对映体竞争酶的同一个活性中心位置，两者的反应速率不同，产生选择性，从而使反应产物具有光学活性。a) 青霉素酰化酶及其催化作用：利用其底物专一性及对映体的选择性进行光学异构体的合成与拆分。.2 2、手性高分子聚合物的制备、手性高分子聚合物的制备(1) (1) 可生物降解的聚

16、酯的合成可生物降解的聚酯的合成(2) (2) 糖脂的合成糖脂的合成3 3、酚树脂的合成、酚树脂的合成 如如辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶的均一介质体系辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶的均一介质体系中，可以催化苯酚等酚类物质聚合，生成酚类聚合物。中，可以催化苯酚等酚类物质聚合，生成酚类聚合物。4 4、导电有机聚合物的合成、导电有机聚合物的合成 如如辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质（如丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。（如丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。5 5、发光有机聚合物的合成、发光有机聚合物的合成 如如辣根过

17、氧化物酶可以在有机介质中催化对苯辣根过氧化物酶可以在有机介质中催化对苯基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物制成二极管，可以发出蓝光。基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物制成二极管，可以发出蓝光。6 6、食品添加剂的生产、食品添加剂的生产 如如利用芳香醛脱氢酶生成香兰素。利用芳香醛脱氢酶生成香兰素。7 7、甾体转化、甾体转化 如可的松转化为氢化可的松的酶促反应，在水如可的松转化为氢化可的松的酶促反应，在水- -乙酸丁酯或水乙酸丁酯或水- -乙酸乙酯组成的系统中，转化率高达乙酸乙酯组成的系统中，转化率高达100%100%和和90%90%。8 8、生物能源、生物能源 如生物柴油。如生物柴油。.有机溶

18、剂中的酶促反应 C-O键的形成键的形成 C-N键的反应键的反应，肽的合成肽的合成 C-C键的形成键的形成 还原反应还原反应 氧化反应氧化反应 异构化反应异构化反应 C-X的反应卤化反应的反应卤化反应.C-O键的形成键的形成 酯类：酯酶和脂肪酶可催化酯合成反应、转酯反应和酸酐水解反应。 环氧化合物 糖苷键的水解和形成 加氧氧化反应 . 酯合成反应 OOOHOH 98% ee, 产率 78%OOOHOAc假单胞脂肪酶(PCL)醋酸乙烯酯 97% ee, 产率 77%OHOHZHNHOAcOHZHNH假单胞脂肪酶(PCL)醋酸乙烯酯.转酯反应转酯反应 H27C10CO2PrOH74% eeH27C1

19、0CO2PrOH+H27C10CO2PrOH98% eeOOH27C10猪猪胰胰脂脂肪肪酶酶( (P PP PL L) )二二乙乙醚醚.酸酐水解 OHMeOO假假单单胞胞脂脂肪肪酶酶( (P PC CL L) )B Bu uO OH H二二异异丙丙醚醚9 93 3% % e ee e, , 产产率率 9 90 0% %CO2HCO2BuHMe.环氧化合反应环氧化合反应 (S)型OArO+RH2NCPhO鼠鼠肝肝微微粒粒体体RNCPhOArOOH+(R)型RNCPhOArOOH.糖的焦磷酸化，糖的异构化 OHOHOOHOPO3-OHUDPU UD DP P- -G Gl lc c焦焦磷磷酸酸化化

20、酶酶OHOHOOHOHOUDPOHOOHOHOHORROHG Ga al l 转转换换酶酶OHOHOOHOHOUDPK=0.17U UD DP P- -G Gl lc c差差向向异异构构酶酶OHOOHOHOUDPOH.糖的衍生物糖的衍生物 OAcOAcONHAcOAcNCO2HNHROHOHOHONHAcOHNHNOOHOOHONHAcOHNHNOOHOOHHOOHOOHOHHOAcHNOCO2HOH固固相相肽肽合合成成UDP-GalGalT转转移移酶酶.醇解醇解 OHOHOOHOHXROH糖糖苷苷酶酶OHOHOOHOHOR.加氧氧化反应 OHCH3CH3OHCH3CH3HO+O2单单加加氧氧

21、酶酶OHOH二二加加氧氧酶酶COOHCOOH+O2.有机溶剂中的酶促反应 C-O键的形成键的形成 C-N键的反应键的反应，肽的合成肽的合成 C-C键的形成键的形成 还原反应还原反应 氧化反应氧化反应 异构化反应异构化反应 C-X的反应卤化反应的反应卤化反应.C-N键的反应键的反应，肽的合成肽的合成.有机溶剂中的酶促反应 C-O键的形成键的形成 C-N键的反应键的反应，肽的合成肽的合成 C-C键的形成键的形成 还原反应还原反应 氧化反应氧化反应 异构化反应异构化反应 C-X的反应卤化反应的反应卤化反应.C-C键的形成键的形成 羟醛反应 酮醛和羟醛转移反应 醛缩合反应 乙酰辅酶A参与的C-C键构成

22、反应 醛加成反应.（1）羟醛反应）羟醛反应POOPOOHOHOHD-FDFOOHPOOHOPOH( (P PO O= =磷磷酸酸盐盐) )+D-Gly 3-PF FD DP P醛醛缩缩酶酶DHAPCHON3+HOOPODHAPN3OHOHOHOH2,Pd(OH)2-CNOHHOOHH.OOHPODHAP+OHPOOHOHRAMAOOHOPOHOHOPOHOH48%HOHOOHOHOH+OCH3CO2-K KD DO O醛醛缩缩酶酶HOCO2-OOHOHOHOHKDOD D- -阿阿拉拉伯伯糖糖丙丙酮酮酸酸盐盐.（2）酮醛和羟醛转移反应 HOCO2-OHPA+OHHOTKHOOHOOH.（3）醛

23、缩合反应）醛缩合反应 HOR1R2+CH3CHOOHCH3OR1R2苯苯甲甲醛醛衍衍生生物物乙乙醛醛酵酵母母酮酮醇醇缩缩合合.（4）乙酰辅酶）乙酰辅酶A参与的参与的C-C键构成反应键构成反应 ORSCoARSCoAOO酰酰基基辅辅酶酶A AR R= =C CH H3 3( (C CH H2 2) )x xx x= =0 0- -7 7硫硫解解酶酶乙乙酰酰辅辅酶酶A A- -酮酮酰酰基基辅辅酶酶A A.（5）醛加成反应）醛加成反应RCOH+HCNOHCRHCNOHCRHCOOHH2O/H+( (S S) )- -醇醇腈腈酶酶异异丙丙醚醚.有机溶剂中的酶促反应 C-O键的形成键的形成 C-N键的反

24、应键的反应，肽的合成肽的合成 C-C键的形成键的形成 还原反应还原反应 氧化反应氧化反应 异构化反应异构化反应 C-X的反应卤化反应的反应卤化反应.还原反应还原反应 OOROROHNADHde 63-89%ee98%R=Me,Et,iPr,PhSOCH3OOSOHOCH3O酵酵母母71%马肝醇脱氢酶.有机溶剂中的酶促反应 C-O键的形成键的形成 C-N键的反应键的反应，肽的合成肽的合成 C-C键的形成键的形成 还原反应还原反应 氧化反应氧化反应 异构化反应异构化反应 C-X的反应卤化反应的反应卤化反应.氧化反应氧化反应 （1）C-H, C=C 氧化 （2）醇氧化 （3）苯酚氧化 （4）羧酸氧化

25、 （5）C-N氧化 .（）（） C-H, C=C 氧化氧化OOOHHENCOPhNCOPhOE.（）（） 醇氧化醇氧化OOHOHHOOHOH+O2EOOHOHHOOCHOH+H2O2.（3）苯酚氧化）苯酚氧化 ROHOHROO.（）（） 羧酸氧化羧酸氧化OCOO-+O2磷磷酸酸盐盐EOOPO32-+ CO2 + H2O2.（5）C-N氧化氧化HNNNNOOHHHNNNNOOOHH+ CO2SODH+ H2O2.有机溶剂中的酶促反应 C-O键的形成键的形成 C-N键的反应键的反应，肽的合成肽的合成 C-C键的形成键的形成 还原反应还原反应 氧化反应氧化反应 异构化反应异构化反应 C-X的反应卤化

26、反应的反应卤化反应.异构化反应异构化反应 NOHNH2HNONH2HHA AC CL L消消旋旋酶酶D-ACLR1HOR2OOHOHOHOR2OHR1OH木木糖糖异异构构酶酶.有机溶剂中的酶促反应 C-O键的形成键的形成 C-N键的反应键的反应，肽的合成肽的合成 C-C键的形成键的形成 还原反应还原反应 氧化反应氧化反应 异构化反应异构化反应 C-X的反应卤化反应的反应卤化反应.C-X的反应卤化反应的反应卤化反应OHI+90%10%I-,H2O过过氧氧化化物物酶酶Ph过过氧氧化化物物酶酶Br-,H2O2OPhOPhBr+CINH2CINH2Br过过氧氧化化物物酶酶B Br r- -, ,H H

27、2 2O O2 2OO过过氧氧化化物物酶酶C CI I- -, ,H H2 2O O2 2OOCI.酶工程酶工程 酶工程的定义 化学酶工程化学酶工程 固定化酶 生物酶工程生物酶工程酶工程的应用范围.酶工程的定义酶工程的定义 酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。 酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。.酶工程酶工程 酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。酶工程主要采用两种方法。一是化学酶工程，即通过对酶的化学修饰或固定化处理，改

28、善酶的性质以提高酶的效率和减低成本，甚至通过化学合成法制造人工酶；另一种是生物酶工程，即用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，从而声查性能稳定，具有新的生物活性及催化效率更高的酶。因此酶工程可以说是把酶学基本原理与化学工程技术及重组技术有机结合而形成的新型应用技术。.酶工程酶工程 酶工程的定义 化学酶工程化学酶工程 固定化酶 生物酶工程生物酶工程酶工程的应用范围.化学酶工程化学酶工程1天然酶工业用酶制剂大多是通过微生物发酵而获得的粗酶，价格低，应用方式简单，产品种类少，使用范围窄。例如洗涤剂、皮革生产等用的蛋白酶；纸张制造、棉布退浆等用的淀粉酶；漆生产用的多酚氧化酶；乳制品中的

29、凝乳酶等。天然酶的分离纯化随着各种层析技术及电泳技术的发展，得到长足的进展，目前医药及科研用酶多数是从生物材料中分离纯化得到的。.化学酶工程化学酶工程2化学修饰酶通过对酶分子的化学修饰可以改善酶的性能，以适用于医药的应用及研究工作的要求。化学修饰的途径，可以通过对酶分子表面进行修饰，也可对酶分子内部进行修饰。主要方法有：酶功能基修饰：通过对酶功能基的化学修饰提高酶的稳定性和活性。例如将-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH，可使酶抗不可逆热失活的稳定性在60时提高了1000倍。交联反应：用某些双功能试剂能使酶分子间或分子内发生交联反应而改变酶的活性或稳定性。例如将人-半

30、乳糖苷酶A经交联反应修饰后，其酶活性比天然酶稳定，对热变性与蛋白质水解的稳定性也明显增加。若将两种大小、电荷和生物功能不同的药用酶交联在一起，则有可能在体内将这两种酶同时输送到同一部位，提高药效。大分子修饰：可溶性高分子化合物如肝素、葡聚糖、聚乙二醇等可修饰酶蛋白侧链，提高酶的稳定性，改变酶的一些重要性质。如-淀粉酶与葡聚糖结合后热稳定性显著增加，在65结合酶的半衰期为63min，而天然酶的半衰期只有2.5min。.酶工程酶工程 酶工程的定义 化学酶工程化学酶工程 固定化酶 生物酶工程生物酶工程酶工程的应用范围.固定化酶 固定化酶（immobilized enzyme），是用物理或化学方法处理

31、水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。 固定化酶在文献中曾用水不溶酶、不溶性酶、固相酶、结合酶、固定酶、酶树脂及载体结合酶等名称。 酶的催化反应依赖于它的活性部位的完整性，因此在固定某一酶时必须选择适当条件，使其活性部位的基因不受影响，并避免高温、强酸及强碱等条件，不使蛋白质变性。.固定化酶 载体结合

32、法：最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。 交联法：依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。 包埋法：酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可

33、用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，工业上用于生产6-氨基青霉烷酸。 酶经过固定化后,比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位,对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如 5-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍.固定化酶 固定化酶的形式多样，可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产；或在反应器中进行批式搅拌反应；也可制成酶膜、酶管等应用于分析化学；又可制成微胶囊酶，作为治疗酶应用于临床。现在又有人用酶膜（包括细胞、组织、微生物制成的膜）与电、光、热等敏感的元件组成一种装置称生物传感器，用于测定有机化合物和发酵自动控制中信息的传递及环境保护中有害物质的检测。最常用的是

34、酶膜与离子选择电极组成的生物传感器，例如脲传感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧电极组成，脲经脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又继续被硝化菌氧化，总耗氧量则通过氧电极反映出电流的变化，用以计算脲的含量。.酶工程酶工程 酶工程的定义 化学酶工程化学酶工程 固定化酶 生物酶工程生物酶工程酶工程的应用范围.生物酶工程生物酶工程 生物酶工程是在化学酶工程基础上发展起来的，是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。因此它亦可称为高级酶工程。 自从70年代初DNA重组技术问世以来，把酶学推进到一个十分重要的发展时期，使它的基础研究和应用研究领域发生着巨大的革命性变化，产生了生物酶工程。 生物

35、酶工程主要包括三个方面：(1)用DNA重组技术(即基因工程技术)大量地生产酶(克隆酶)；(2)对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶(突变酶)；(3)设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。. 酶基因的克隆和表达技术的应用使我们有可能克隆各种天然的蛋白基因或酶基因。先在特定的酶的结构基因前加上高效的启动基因序列和必要的调控序列，再将此片段克隆到一定的载体中，然后将带有特定酶基因的上述杂交表达载体转化到适当的受体细菌中，经培养繁殖，再从收集的菌体中分离得到大量的表达产物我们所需要的酶。一些来自于人体的酶制剂，如治疗血栓栓塞病的尿激酶原，就可以用此法取代从大量的人尿中的提取。

36、此外还有组织纤溶酶原激活剂(TPA)与凝乳酶等一百多种酶的基因已经克隆成功，其中一些还已进行了高效的表达。此法产生出大量的酶，并易于提取分离纯化。. 近几年兴起的另一个新研究领域：酶的选择性遗传修饰，即酶基因的定点突变。研究者们在分析氨基酸序列弄清酶的一级结构及X线衍射分析弄清酶的空间结构的基础上，再在由功能推知结构或由结构推知功能的反复推敲下，设计出酶基因的改造方案，确定选择性遗传修饰的修饰位点。现在人们已掌握技术，所以只要有遗传设计蓝图，就能人工合成出所设计的酶基因。酶遗传设计的主要目的是创制优质酶，用于生产昂贵特殊的药品和超自然的生物制品，以满足人类的特殊需要。 . 需要改善的酶学性质包括：对热、氧化剂、非水溶剂的稳定性；对蛋白水解作用的敏感性；免疫原性；最适pH、离子强度及温度；催化效率；对底物和辅助因子的专一性与亲合力；反应的主体化学选择性；催化效率；别构效应；反馈抑制；多功能性；在纯化或固定化过程中酶的功能和理化性质等。目前的关键问题在于如何设计超自然的优质酶基因，即如何作出优质酶基因的遗传设计蓝图。 .酶工程酶工程 酶工程的定义 化学酶工程化学酶工程 固定化酶 生物酶工程生物酶工程酶工程的应用范围.酶工程的应用范围 对生物宝库中存在天然酶的开发和生产； 自然酶