杀菌剂毒力测定

1、.1 杀菌剂生物测定杀菌剂生物测定.2第三章第三章 杀菌剂毒力测定杀菌剂毒力测定l室内测定与田间试验有一定的差异l杀菌剂田间药效试验受寄主(作物)、环境、以及发病阶段的影响较大。.3第三章第三章 杀菌剂毒力测定杀菌剂毒力测定l多菌灵对镰刀菌及由镰刀菌引起的赤霉病、恶苗病的室内毒力测定和田间药效比较一致。l但多菌灵在室内测定对由镰刀菌引起的棉花枯萎病效果较好，而田间多菌灵对棉花枯萎病效果较差。.4第三章第三章 杀菌剂毒力测定杀菌剂毒力测定l三环唑（黑色素合成抑制剂）在室内测是无效的。l嘧啶胺类杀菌剂（嘧菌胺）室内对灰霉病孢子萌发没有抑制作用（300L/ ml），但在植物上(1L/ ml)，对灰霉

2、病防效较好。(该类药剂能抑制病菌甲硫氨酸的生物合成和细胞壁降解酶的分泌，从而影响病菌侵入寄主植物).5一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1、孢子萌发法 (spore germination method)l快速。广泛用于保护剂的测定l此法适用于抑制病菌能量合成系统，而使孢子不能萌发的杀菌剂。.6一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.1 玻璃器皿的处理l清洁：以洗液浸泡数十分钟,用自来水冲洗, 用蒸馏水清洗,防尘干燥.l载玻片保存于70%的酒精溶液内.7一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.2 液剂的附着lA、混合滴加l将供试药剂与孢子悬浮液混合滴加于载玻片上

3、。对水溶性药和稳定的悬浮剂可得到正确的结果。对于非水溶性药剂，因沉降快而不易获得正确结果。l简单迅速，适于大规模初筛。测得结果一般偏高。.8一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法lB、定量滴加药膜法l定量滴加药液（用水或有机溶剂均可），形成均匀的药膜，再滴加孢子液。l许多有机溶剂（丙酮、乙醚）表面张力小，不易形成均匀的药膜，因此，应采用凹玻片。防尘条件下干燥。.9一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法lC、装置喷雾l利用精确喷雾装置将药液喷于载玻片上，干燥后滴加孢子悬浮液。.10一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.3孢子悬浮液的配制l孢子萌发法常用菌种l马铃薯晚疫病，

4、水稻稻瘟病，小麦赤霉病，甘薯黑疤病，水稻胡麻叶斑病，玉米大斑病。.11一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.3孢子悬浮液的配制l真菌在一定条件下才产生孢子，一般来说，生殖生长的条件比较严格。lA、改变培养基成分：先在高浓度养分的培养基上培养，再移到营养成分较低的培养基中，可促进孢子的产生。.12一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.3孢子悬浮液的配制lB、选用不同培养基：l植物质培养基或利用植物的组织或它们的煎汁往往可促进真菌产生孢子。.13一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.3孢子悬浮液的配制lC、培养基的理化性状l增加培养基的酸度，可促进某些真菌产生孢

5、子。固体培养基上比液体培养基上容易产生孢子。.14一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.3孢子悬浮液的配制lD、病菌培养条件l高温、低温或高低温交替有时可促进孢子的产生。一般半知菌在有光照的条件下易产生孢子。但有的病菌在无光下易产生孢子。.15一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.3孢子悬浮液的配制l配制：一般将已培养好的菌种（斜面或三角瓶培养）加入无菌水，用接种环在表面轻轻摩擦，使孢子悬浮于水中，然后用双层纱布过滤，除去菌丝体和培养基碎块。最好在1000r/min的离心机上用无菌水洗涤三次。l一般规定孢子的浓度最好是5万/ml。10*10观察时，每个视野约有35个。.

6、16一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l孢子浓度可用计数器测定l纽鲍尔（Neubauer）血球计数器。l边长为0.05mm的小方格，深度为0.1mm.17一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.4 孢子萌发条件lA、温度：各种真菌孢子萌发的最适温度不同。适于低温的孢子，如小麦黑穗病菌的厚垣孢子，温度超过2122 就不能萌发。.18一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.4 孢子萌发条件lB、湿度：真菌孢子一般要求在水滴中才能萌发，但也有少数真菌孢子，如白粉病菌的分生孢子，在相对湿度很低的情况下也能萌发。.19一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.4 孢

7、子萌发条件lC：光照：光照对多数真菌孢子萌发的影响不大，但对某些真菌孢子有刺激或抑制作用，如光照可刺激水稻黑粉病菌厚垣孢子的萌发，抑制小麦秆锈病菌夏孢子的萌发。.20一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.4 孢子萌发条件lD：空气：孢子萌发多需要空气，所以水滴表面的孢子比沉在水滴中的萌发好。但玉米黑粉病菌孢子萌发需要15%的CO2。.21一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.4 孢子萌发条件lD：养分：有的不需外源养分，有的则必须由外界提供养分。l植物组织煎汁常常是促进孢子萌发的物质，其刺激作用是因为含有生长素或挥发性物质。但有研究表明，萌发促进物质可增加孢子对药剂的抵

8、抗力。.22一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l有些病菌在蒸馏水中萌发不好，可加入某些促进物质。许多病菌孢子，按10毫升孢子液加入0.1%葡萄糖溶液0.01毫升，可使孢子萌发整齐。l玉米小斑病菌孢子，适当加入一点玉米苗的新鲜汁液，在26下2h，孢子萌发率高，整齐。.23一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.5 调查方法l一般病菌培养2024小时即可镜检。一般在100200倍下镜检，每处理随机检查200个孢子。l孢子萌发标准：芽管大于孢子短半径即算萌发。l或以孢子囊产生游动孢子为萌发标准，如马铃薯晚疫病菌。.24一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l1.5 调查方法

9、l对照萌发率至少大于80%，低于80%应重做。%100对照萌发率处理萌发率对照萌发率抑制萌发率.25Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl1. 试验靶标l易产生孢子,便于镜检,如稻瘟病菌,梨黑星病菌等.在培养基上培养,或将病组织保湿培养,待产生孢子后备用。.26Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl2. 孢子悬浮液配制l将培养好的病原真菌孢子用去离子

10、水从培养基或病组织上洗脱、过滤、离心（1000r/min）5min，倒去上清液，加入去离子水，再离心。最后用去离子水将孢子重悬浮至每毫升105107个孢子，并加入0.5%葡萄糖溶液。.27Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl3. 药剂的配制l水溶性药剂直接用水溶解，其它药剂选用合适的有机溶剂（甲醇、丙酮、二甲基亚砜等）溶解，再用0.1%的吐温80水溶液稀释，设置57个浓度，有机溶剂最终含量不超过2%.28Determining fungicide inhibition

11、of pathogen spore germination on concave slidesl4. 药剂处理l使药液与孢子悬浮液在小试管中等量混合均匀。用微量加样器吸取上述混合液滴到凹玻片上，然后架放于带有浅层水的培养皿中，加盖保湿培养。每处理不少于3次重复。.29Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl5. 调查l当空白对照孢子萌发率达到90%以上时，每重复了随机观察3个以上视野，调查孢子总数不少于200个，分别记录萌发数和孢子总数。.30Determining fun

12、gicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl6. 数据处理l计算校正的孢子萌发率，求出毒力回归线，EC50，EC90及95%置信限。.31一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l2 生长速率法(mycelium growth rate test)l将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制成带毒培养基平面，在平面上接种病原菌，以病原菌生长速度快慢来判定药剂毒力大小。.32一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l2 生长速率法l病菌易培养，菌丝生长快，不易产生孢子。l棉花炭疽、红麻炭疽、小麦赤霉等病菌

13、具有生长快速、整齐、平伏的特点，有利于此法测定。.33一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l2 .1 含毒培养基的制备l一般以1ml药液加入 9ml培养为宜,这样的比例不会影响培养基凝固.l对挥发性强、受热易分解的药剂应注意培养基的温度，最好当培养基冷却到50左右时再加入药剂。.34一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l2 .2 接种病原菌l菌饼接种法：0.4cm的打孔器打出菌饼，用接种针或镊子放入含毒培养基的中央。.35一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l2 .2 接种病原菌l划线接种法：用接种针沾取病菌孢子液在培养基上划一直线进行接种，培养一段时间后，测量菌丝伸向

14、直线垂直方向的长度。.36一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l2 .3结果检查及其表示方法l十字交叉测2个直径，以其平均值代表菌落大小。%1001菌饼直径对照菌落直径菌饼直径处理菌落直径抑制生长率.37一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l3 滤纸片附着法(adsorption technique)l此法是将真菌孢子悬浮液用适当方法附着在灭菌的滤纸片上，使其接触一系列不同浓度的药剂，放在一定条件下培养一定时间后，观察菌丝生长情况。.38一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l3 滤纸片附着法l定性滤纸灭菌（130，1h），70-80%的酒精20-30分钟， 滴加孢子悬浮

15、液，无菌干燥，浸入药液中10分钟，放入培养基上培养。.39一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l4 扩散法（抑菌圈法,detection of inhibition zone）l基本原理是在已接种的琼脂培养基上加少量的抗菌物质，使其接触培养基和病原菌，经一定时间的培养后，接触部分的周围由于抗菌物质的扩散而产生抑菌圈。l扩散法广泛用于医用和农用抗菌物质的筛选和抗菌性物质有效成分的定量.40一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l4 扩散法l管碟法：国际公认的标准抗菌素效价测定l将直径9.0cm的培养皿保持水平，倒入约20ml琼脂培养基，凝固后作为底层，然后将马铃薯蔗糖琼脂培养基溶化

16、，在5060时，接种供试菌（细菌、霉菌孢子），取其少量均匀倒入培养皿的底层培养基上，做成试验平面（菌层）。.41一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l4 扩散法l管碟法：l在试验平面上放4个牛津杯（外径8mm，内径6mm，高10mm）。用移液管将已知浓度的标准液和不同浓度的待测液移圆筒内，在适温下培养，让其形成抑菌圈。测其直径。.42一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l4 扩散法：农用抗菌素效价测定l抗菌素效价的衡量单位分两类：lA、稀释单位，将1mg抗菌素配成溶液，在一定条件下进行稀释，对某一细菌能抑制其生长的最高稀释度，即为1mg抗菌素所含的单位。如1mg青霉素，在一定条

17、件下稀释3600倍能抑制白色念球菌的繁殖，则1mg青霉素含有3600单位。.43一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l4 扩散法：农用抗菌素效价测定lB、重量单位，将纯净的抗菌素直接作为抗菌素效能的衡量单位，即1g相当于于1个单位。例如，纯净的1mg链霉素含有1000个单位。.44一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l4 扩散法：l滤纸片法：药剂加于一定大小的圆形滤纸片上。l孔碟法：在培养基上打孔或留孔，药液加于此孔内。l滴下法：利用注射器、毛细管、移液管等将药液直接滴加于培养基上。.45一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l5 稀释法(最低抑制浓度测定法, deter

18、mination of minimum inhibitory concentration)l在液体或固体培养基中，加入一系列浓度的供试药液，分别注入灭菌的试管或培养皿内，在其中接种供试菌进行培养，把具有使病菌发育完全停止的最低浓度定为抗菌力的指标。l此法也可用抗菌素的效价测定。.46一、杀菌剂毒力测定方法一、杀菌剂毒力测定方法l6 气体效力测定法l一般把表示挥发物质的抗菌力叫气体效果。l一般在灭菌的培养皿内固定的培养上接种供试菌，将皿倒置，在盖内放上药剂，用2%洋菜液或玻璃纸密封，调查适温下的病菌生长状况。 .47二、不同类型杀菌剂效力测定方法二、不同类型杀菌剂效力测定方法l1 喷布用杀菌剂效

19、力测定l1.1 鲜叶孢子萌发试验法l在（梨等的）叶表面撒布药剂，喷布梨黑斑病菌孢子悬浮液,叶片放在保湿的培养皿内，在25-28保持20小时后，用龙胆紫或亚甲基蓝（0.1%水溶液）将芽管染色,将叶片风干,用涂有甘油透明胶的盖玻片轻轻压在叶面上,等明胶凝固后,剥取盖玻片,镜检。.48l梨黑斑病二、不同类型杀菌剂效力测定方法二、不同类型杀菌剂效力测定方法.49l1.1 鲜叶孢子萌发试验法l苹果叶（苹果灰霉病菌(Botrytis cinerea )孢子悬浮液）也可用此法。二、不同类型杀菌剂效力测定方法二、不同类型杀菌剂效力测定方法.50l1.2 叶片接种试验法l在附着药剂的叶片上接种病原菌，一定时间后

20、观察发病情况，以判断药剂效果。此法可用于甘薯黑星病，白菜软腐病、麦类叶白粉病等。二、不同类型杀菌剂效力测定方法二、不同类型杀菌剂效力测定方法.51以蚕豆法（高坂氏法）为例，测定步骤如下：a）用适当方法在蚕豆成叶（有一对小叶的复叶）的两面撒布药剂或将蚕豆叶在药液中迅速浸沾一下，使叶片充分附着剂，在室内干燥后，置于保湿的培养皿内。b）将在马铃薯洋菜培养基平面上培养（28）3d的水稻纹枯病菌（Hypochuns sasakii）用打孔器，将带菌的培养基打成直径为5mm的小块，放在药剂处理过的叶片中部，并盖上盖玻片（7mm7mm）进行接种。c）接种后把叶片放到恒温培养箱内（30）约20h后调查菌丝生长

21、长度，测定对菌丝的抑制作用。同时在接种3d后，当对照组的发病面积扩展到全叶面时，观察药剂处理后的发病程度，判断药剂的防治效果。.52以蚕豆法（高坂氏法）为例，测定步骤如下：d）在未进行药剂处理前接种病菌，当发病面积到全叶面积的1/101/5时（接种后24h左右）取出病叶，进行药剂处理，药剂干后，置培养皿内，进行上述保温培养，12d 内观察对病势进展的抑制作用。e）测定残效时，在蚕豆的青苗上（也可剪取室内水培的幼苗枝叶）洒布药剂，在预定的施药若干天后，采集附有药剂的叶片，同上进行接种试验。f）在对照组病斑扩大到全叶面时进行药效调查。出现的病斑（合并后的病斑）大小（面积），以发病面积对全叶面积的比

22、率来表示。进行本试验的蚕豆尽量一致（叶片所在部位的大小），一个试验处理的供试叶数至少要10枚以上。.53l1.3 幼苗接种试验法l一般认为此方法是最可信赖的方法，稻瘟病、稻胡麻叶斑病、稻纹枯病、甘蓝黑斑病等可用此法。l稻胡麻叶斑病二、不同类型杀菌剂效力测定方法二、不同类型杀菌剂效力测定方法.54例如甘蓝黑斑病的接种试验，是把小油菜、白菜栽培在盆中，当长到35片真叶时，将马铃薯洋菜培养基上培养（2528）一周的黑斑病菌孢子悬浮液（可用灭菌水制备，如果用马铃薯浸煮液或Hepkins培养母液制备孢子悬殊浮液，则发病率可提高），用玻璃喷雾器喷出接种，接种前后进行药剂处理。把喷药、接种后的植物放入接种箱

23、或适当的保温器中，在2528下保持24h，取出放到室内有阳光处或温室内，保持25左右的室温。当看到有病斑生时，调查病斑数目。若病斑过多或造成叶片枯萎时，应确定适当的被害标准，以判定药效。.55l2 种子杀菌剂效力测定l通常采用将病原菌附着在种籽的试验法。人工制备带菌种籽常用的病原菌有：棉花炭疽病菌，稻麦赤霉病菌等。l种子杀菌剂的作用是抑制附着或潜伏在种苗上病原菌的活动，以防止田间发病。它不能损害在土壤中的种子发芽，但能抑制寄生在幼苗而引起发病的有害病菌，以便使幼苗生长良好的。 二、不同类型杀菌剂效力测定方法二、不同类型杀菌剂效力测定方法.56例如，用棉花炭疽病菌对棉花籽接种进行药剂效力测定时，

24、先把棉籽用温汤浸种，以除去棉籽上的杂菌。晾干后拌以一定量的棉花炭疽病孢子悬浮液，再凉到七成干，进行药剂处理；然后将药剂处理过的棉籽置于培养皿内培养基平面上，一定时间后观察种籽发病情况和发芽率，比较效果。.57l3 土壤杀菌剂效力测定l供试土壤不能仅限于1种，至少应选2-3种土壤。l有直接法和盆栽试验法二、不同类型杀菌剂效力测定方法二、不同类型杀菌剂效力测定方法.58l3 土壤杀菌剂效力测定l直接法：在玻璃容器内装入病原菌和土壤，进行药剂处理，直接判断杀菌效果。l土壤过筛、灭菌、接种病原菌、注入药液、培养、用水将土壤冲掉，取出菌丝、菌核、在培养基上培养看能否发育。二、不同类型杀菌剂效力测定方法二

25、、不同类型杀菌剂效力测定方法.59Zentmyer方法：将风干土用8目筛筛过，装入高压灭菌的玻璃管内（直径2cm，长8.5cm），装土厚度为2.5cm。其上放入一定量培养好的供试菌丝或菌核，然后再装入2.5cm厚的灭菌土，注入5ml供试药液，在适温下培养24h后，将玻璃管内的土壤倒在金属网上，用自来水将土壤冲掉，取出菌丝、菌核、置清洁的滤纸上，除去水分，接种在酸性真菌培养基上（即加有0.05%柠檬酸的马铃薯洋菜培养基），在适温下培养，观察能否发育，以判定药效。也可采用下述方法：菌种用秧苗枯萎病菌类（Rhizoctonia SP,Pythium SP,Fu Sarium Oxysporum）、油

26、菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）等。在普通试管内（直径1.5cm）加入洋菜培养基5ml，培养菌核病（高层培养），当菌丝生长到布满全培养基时，将灭菌土和定量药剂混合（含水量为30%左右）每支试管内轻轻装入20g混合药的土壤，保持在28下，然后测定管壁上菌丝的伸长度。 .60荻原氏法：荻原氏（1960）报道培养皿的试验方法。这是挥发性小的药剂对土壤表层病菌（秧苗枯萎病菌、菌核病菌）毒力测定的有用方法。在直径9cm的培养皿内，加入风干土20g，使其均匀平整，在土壤表面喷布一定浓度的药液1.7ml。若用粉剂，可取一定量的药粉混入土中，或将纱布叠成双层，把药粉包好，均匀地撒

27、在土表。在土表中央放一盖玻片，上面放洋菜培养基块，并接种菌核病菌。保存在28的保湿器中，一定时间后测定菌丝伸向土壤表面的长度。用蒸气灭菌供试土壤。也可用滤纸片代替盖玻片，用秧苗立枯病菌(Rhizoctonia SP)代替菌核病菌。如果在培养皿的整个平面播种小油菜类种籽，可以明确的判定药剂的药效和药害。.61l3 土壤杀菌剂效力测定l盆栽法：用致病性强的秧苗枯萎病菌进行盆栽试验，一般可得到与田间药效一致的结果。二、不同类型杀菌剂效力测定方法二、不同类型杀菌剂效力测定方法.62将秧苗枯萎病菌在麦麸培养基上培养（28）10d左右取出，尽量在无菌条件下凉干（达到能过筛的程度）将其松散成10筛目大小一致

28、的颗粒。取2g加入蒸汽消毒的（100，30min）1L土样中，混合均匀，然后取混合好的带菌土100ml装入直径为78cm普通花盆的孔洞用滤纸或吸湿纸堵住，而不用碎瓦片。然后根据药剂性能用相应的方法（混入，溶于水全面灌注或具有挥发性药剂，注加于中心部位）进行处理。立即或过一定时间后，播种绿豆，瓜类种籽510粒，放在2030的室内、温室或露天，在土表尚未太干时灌水，并观察发芽，幼苗生长状况，通常经过7d14d，当有侵染力的病菌生存的情况下，幼苗生长不良，即可判断有无效果。 .63以菌核病菌为供试菌种时，将灭菌土放入盆钵后，再把培养好的菌核均匀地放到土表（用直径7cm的盆，每盆放1020粒），然后用

29、灭菌土把菌核完全复盖好，再进行药剂处理。菌核应采用在马铃薯洋菜或稻草培养基上，25左右培养23周的、成熟度一致的菌核。如果将菌核在甜菜培养基上（即在甜菜渣培养基中加等量水进行高压灭菌）进行培养，可得到非常大的菌核。一次进行大量试验时，盆内可多半装不灭菌的土，仅在上部装2cm 厚的灭菌土即可。试验用的盆钵不限于素烧花盆，也可用上了釉的花盆或培养皿、搪瓷盆等容器。.64l4 果实防腐效力测定l先用砂纸轻擦果实，使果皮擦伤，也可用刀尖或昆虫针刺伤。将果实放在药液中浸渍一定时间或喷上药液，晾干后，进行接种，然后将接种后的果实放入玻璃保湿器，在25下保持5天，观察发病情况。二、不同类型杀菌剂效力测定方法

30、二、不同类型杀菌剂效力测定方法.65l5 内吸杀菌剂效力测定l英国等常用室温下沙培西红柿苗法：当苗高15cm左右时，将药液灌于幼苗根部或茎部注射或用羊毛脂混合涂茎，处理57天后接种早疫病菌孢子，在室温下让其发病，观察病斑发生程度。二、不同类型杀菌剂效力测定方法二、不同类型杀菌剂效力测定方法.66l5 内吸杀菌剂效力测定l还可将普通盆栽的蚕豆芽拔出(不使根损伤),于药液中浸一定时间后,再放置原位继续栽培,待完全成活后,接种赤霉病菌,并判断其效果。二、不同类型杀菌剂效力测定方法二、不同类型杀菌剂效力测定方法.67三、抗病毒剂测定方法三、抗病毒剂测定方法l1 病毒磨擦接种法l切取少量植物病症严重的新

31、组织，放入研钵内，加入与组织鲜相等或5倍量的1/15mol磷酸缓冲液，充分磨碎（先把组织冰冻，可更易磨碎）。把棉球在制备的病组织汁液中浸蘸一下，用镊子夹住棉球在接种植物的叶面沿其支脉方向轻轻擦1-2次。为了提高接种效率，最好在含病毒的汁液中加少量金刚砂（400-600目）再接种。.68三、抗病毒剂测定方法三、抗病毒剂测定方法l2 药剂施用方法l2.1 浸渍法l2.2 组织培养法l2.3 涂茎法l2.4 撒布法l2.5 土壤使用法.69四、杀菌剂温室植株测定法四、杀菌剂温室植株测定法l杀菌剂的开发：l室内测定l温室植株测定l田间试验.70四、杀菌剂温室植株测定法四、杀菌剂温室植株测定法l1、供试

32、植物l我国常用植物：小麦、水稻、黄瓜、棉花、番茄、马铃薯。l植物不同发育时期感病性不一样，黄瓜霜霉病成株易感病。l兼性寄生菌易侵害弱的寄主，专性寄生菌要求正常植物代谢作为其营养，如小麦锈病接种时，健壮的植株才易接种成功。.71四、杀菌剂温室植株测定法四、杀菌剂温室植株测定法l2、供试菌种l易培养，易产生大量孢子，应是我国主要病害的病原菌。l小麦锈病菌、黄瓜霜霉病菌目前不能在常规培养基上培养，可植株培养。霜霉病菌需新鲜孢子接种才能成功。.72四、杀菌剂温室植株测定法四、杀菌剂温室植株测定法l接种时应注意l（1）病原菌的培养条件及其退化l不同培养基培养的病菌，其致病力往往不同。l有的菌种连续培养，

33、致病力减弱，须经过植物接种及重新分离的方法使其恢复致病力。.73四、杀菌剂温室植株测定法四、杀菌剂温室植株测定法l接种时应注意l（2）病原菌的菌系及生理小种l来源于不同地区或不同寄主，其致病力往往有很大差异。.74四、杀菌剂温室植株测定法四、杀菌剂温室植株测定法l接种时应注意l（3）接种量l一般病害需要一定数量的孢子接种才能发病。一般孢子浓度要在低倍镜下每视野20-30个孢子。.75四、杀菌剂温室植株测定法四、杀菌剂温室植株测定法l3、接种时环境因子的控制l接种后需保持一定时间的温度，才能满足病菌萌发和侵入寄主的要求。l马铃薯晚疫病菌在低温时才能产生大量孢子，但孢子的侵入寄主后又需要较高的温度

34、。.76四、杀菌剂温室植株测定法四、杀菌剂温室植株测定法l4、接种方法l对气流和雨水传播的病害，可采用喷洒法、喷粉法及涂抹法接种。如病菌主要是气孔侵入，接种时主要是叶背面，对由伤口侵入的病害，可先将植物表面用细砂损伤。.77四、杀菌剂温室植株测定法四、杀菌剂温室植株测定法l4、接种方法l锈病和白粉病菌的接种，可直接用孢子粉（用滑石粉稀释）喷撒于植物叶片上。.78Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl盆栽法测定防黄瓜霜病试验l1、试材准备l选用感病黄瓜品种盆栽，幼苗长至4到6片真叶期备用。.79Po

35、tted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl2、孢子囊悬浮液的准备l选择病源叶片，用4蒸馏水洗下叶片背面霜霉病菌孢子囊，配成悬浮液（浓度为每毫105到107个孢子囊),4 下存放备用。.80Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl2、药剂的配制l水溶性药剂直接用水溶解，其它药剂选用合适的有机溶剂（甲醇、丙酮、二甲基亚砜等）溶解，再用0.1%的吐温80水溶液稀释，设置57个浓度，有机溶剂最终含量不超过1%.81Po

36、tted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl3、药剂处理l将药液均匀喷施于叶片两面至全部润湿，待药液自然风干后备用。试验设不含药剂的处理作空白对照。.82Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl4、接种与培养l将新鲜孢子囊悬浮液喷雾接种于叶片背面，每处理不少于5盆，每盆2株，保护性试验在药剂处理后24小时接种，治疗性试验在药剂处理前24小时接种。接种后培养，光照/黑暗各12小时，温度为17到22，RH90%以上。

37、.83Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl5、调查l根据空白对照发病情况，对接种叶片进行分级调查：l0级：无病l1级：病斑面积5%以下；l3级：610%l5级：1125%l7级：2650， 9级：50%以上.84Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl6、数据处理l根据病情指数计算防治效果，求出毒力回归线，EC50、EC90及95%置信限。.85五 杀菌剂的抗药性测定1 抗药性测定的要点1）测定标准：

38、测定时并不是观测其绝对数值，而是将测定值与标准菌株进行比较。标准菌株是指历来存在于自然界中的普通菌株或菌株群。2）检测菌的采集和处理： 单孢分离培养或单细胞分离培养。3）药剂的选择和处理：.86五 杀菌剂的抗药性测定4）试验方法的选择： 将从田间采集的病原菌进行离体测定。 一种方法是使供试菌产生一定反应的药剂浓度（LD50或MIC）；另一种是比较在一定药剂浓度下与不添加药剂情况下供试菌的生长状况，推测药剂对菌生长的抑制程度。.872 抗药性测定方法：1）水稻稻瘟病菌（pyricularia oryzae) 对春雷霉素的抗药性测定采用MIC法；对有机磷的抗药性测定采用MIC法，孢子萌发法或菌丝生

39、长法。五 杀菌剂的抗药性测定.88稻瘟病菌的分离和春雷霉素、有机磷抗性菌的测定 从田向采集的病稻样本放在聚氯乙烯或聚乙烯袋内用橡皮圈封住。分离之前保存在5冰箱内(可保存一年左右)。分离时首先切取病斑及其外围部并浸于80乙醇中，然后再浸于0.1升汞水中，最后用无菌水洗净，进行表面消毒。消毒液也可用20倍安替佛民(antiformine)液代替。培养皿中注入一薄层琼脂平板，平板表面放置病组织块并使其充分附着琼脂表面。在20-27下用近紫外光照射，2-7天后病斑部即产生孢子，孢子可在立体显微镜下用眼科手术刀进行单孢分离并接种，在26-27下培养，大约十天后菌丝扩展，然后用打孔器打成菌块，菌丝朝上移置

40、到含药PSA培养基和不含药PSA培养基表面，在26-27下培养4-7天，通过测量菌落直径求药剂对菌丝生长抑制率。.89稻瘟病菌的分离和春雷霉素、有机磷抗性菌的测定 春雷霉素抗性程度大，采用l0-l00ppm之间任何浓度均可进行抗药性测定(10 ppm对敏感菌抑制率约60，对抗性菌不抑制。100ppm对敏感菌抑制率90，抗性菌约20)。配制春雷霉素要用柠檬酸缓冲掖将pH值调到5左右。 有机磷杀菌剂的田间抗性菌抗性程度多较弱，与普通菌区别本大。对异稻瘟净来说，一般可采用l00mM浓度进行测定(在此浓度下敏感菌抑制率约90，抗性菌约40或以下)。.90五 杀菌剂的抗药性测定2 抗药性测定方法：2）

41、苹果黑星病菌(Venturia inaequalis) 本病菌对多果定、苯来特、甲基托布津已产生抗药性。在进行抗药性测定存在的问题是该病原菌在培养基上生长的很慢，将本菌从寄主病斑部进行单孢分离直至作为供试菌进行抗药性测定需要相当长的时间，因此多采用从病斑部直接采集孢了进行测定的方法。.91五 杀菌剂的抗药性测定2 抗药性测定方法：2） 苹果黑星病菌(Venturia inaequalis) 本菌对多果定的抗药性采用子囊孢子萌发的方法进行测定 。对苯来特和甲基托布津的抗性，通常采用孢子荫芽率、萌发管长度及菌丝生长的方法进行测定。这两种药剂属细胞分裂抑制剂，抑制菌丝生长比抑制孢子萌发的能力强，因此

42、一般认为采用测量萌发管或菌丝生长的方法比较适合。.92五 杀菌剂的抗药性测定2 抗药性测定方法：3） 梨黑星病菌(Venturia nashicola) 已有报道指出，采用菌丝生长的方法证明本菌已对苯来特和甲基托布津产生了抗性。与苹果黑星病菌同样，本菌在培养基上生长很慢，分离培养测定所需时间长。一般认为，进行抗药性测定不宜采用孢子萌发的方法，梅本等建立了以异常萌发作指标的萌发管隔膜法。.93萌发管隔膜法测定梨黑星病菌对苯并咪唑类药剂抗药性试验 在PDA培养基中加入供试药剂，然后高压蒸气灭菌。从梨的叶采集分生孢子放在含药琼脂培养基表面。为防止混入细菌的繁殖，可放在稍低温度下(15)使其发芽。大约

43、经48小时即产生萌发管。但为可靠起见，最好在72小时后进行调查，观测萌发管有无隔膜。一般认为苯来特、甲基托布津均采用0.2ppm浓度为宜。 也可采用子囊孢子进行测定。此时，可将形成子囊壳叶片用叶穿孔器切取病组织片，放在水中浸3-5分钟，然后贴在培养皿盖内表面，使子囊孢子落在培养皿内含药PDA培养基表面。其他过程与上述相同。.94五 杀菌剂的抗药性测定2 抗药性测定方法：4）梨黑斑病菌(Alternara kikuchiana) 本菌对多氧霉素的抗药性已成为问题。多氧霉素对孢子萌发抑制并不显著，但具有强烈的使萌发管膨润的作用。因此，可通过异常萌发或抑制菌丝生长的方法进行抗药性测定。.95五 杀菌

44、剂的抗药性测定2 抗药性测定方法：5）柑桔青霉病菌(Penicillium italicum)和绿霉病菌(Penicillium dijitatum) 本菌对苯来特、甲基托布津及涕必灵产生抗药性，并观察到前两种药剂之间具有交叉抗药性。与涕必灵之间有的有交互抗药性，有的则不那么明显。抑霉唑(R-23979)尽管与这三种药剂属同一系列药剂，但也不具有交叉抗药性。 本菌容易形成孢子，菌丝生长也快，所以很容易在含药培养基上接种孢子或菌丝块。通过测定菌落的生长进行抗药性测定。此外，采用果实测定在寄主上效果的方法也很容易进行。.96五 杀菌剂的抗药性测定2 抗药性测定方法：5）柑桔青霉病菌(Penicillium italicum)和绿霉病菌(Penicillium dijitatum) 已发现苯来特甲基托布津、涕必灵药剂对本菌同属的梨青霉菌(Pe