PCR产物的胶回收分离纯化

1、PCR 产物的胶回收分离纯化一、实验仪器1、琼脂糖凝胶电泳系统2、紫外观察分析仪3、离心机4、单面刀片5、恒温水浴锅二、试剂1、DNA 回收试剂盒2、50 X TAE3、ddH2O三、步骤1 在紫外灯下切分含 DNA 的琼脂糖块， 尽可能除去多余的 琼脂糖放入 1.5ml 离心管中。4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1卩l 进行计算。5. 向胶块中加入胶块融化液 DR-I Buffer ， DR-I Buffer 的加量如下 表：凝胶浓度DR-I Buffer 使用量1.0 3 个凝胶体积量1.0% 1.5%4 个凝胶体积量1.5% 2.0%5 个凝胶体积量6. 均

2、匀混合后75 C加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45C加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约610分钟）。 注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响 DNA 的 回收率。7. 向上述胶块融化液中加入 DR-I Buffer 量的 1/2 体积量的 DR-II Buffer ，均匀混合。当分离小于 400 bp 的 DNA 片段时，应在此溶 液中再加入终浓度为 20% 的异丙醇。8. 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。9. 将上述操作 7 的溶液转移至 Spin Column 中， 12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 注）如

3、将滤液再加入 Spin Column 中 离心一次，可以 提高 DNA 的回收率。10. 将 500 卩 I 的漂洗液 Rinse A 加入 Spin Column 中，12,000 rpm 离 心 30 秒钟，弃滤液。11. 将 700 卩 l 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。注）请确认 Rinse B 中已经加入了指定体积的 100% 乙醇。12. 重复操作步骤 11。13. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml 的离心管上，在 Spin Column膜的中央处加入 25卜l的灭菌蒸馏水或 Elution

4、 Buffer,室 温静置1分钟。注）把灭菌蒸馏水或 Elution Buffer加热至60C使用时有利于提咼洗脱效率。14. 12,000 rpm离心1分钟洗脱 DNA。将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20 C15琼脂糖凝胶电泳检测回收产物目的DMA胶块Spin Column移奎 1 5 ml Tuba溶浪移至£pi门Column融超胶块加 El Sion 呂 ufferDN4落逾DR-( Buffer )DR-ll Buffer 1Rinse 人!淸洗Spin ColumnRinse B *制备:溶胶液：6 M NaCIO 4 (pH 5.2)，0.03M NaAC(pH 5

5、.2)溴酚红少许洗液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0)70%乙醇存储液： TE buffer (10 mM Tris-cl ，0.1 mM EDTA ，pH 8.0).注意事项1. 电泳的 buffer 和 gel 都是新制的， 切胶的台子清理干净， 刀片最好洗净灭菌， 总之一句话就是保证切下的带没有外源 dna 污染。2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以 用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴 树脂眼镜就可以了。 要是非常害怕紫外照射， 或者对于胶有特殊要求， 例如要求 不含EB,可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在 胶上的位置进行切胶。4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下 与带刻度的尺子一起照相。由于