11-16细胞工程复习

1、胞增梭 种形起氨量相定量的第十一章动物细胞培养与表达制备药用蛋白名词解释： 动物细胞培养：是模拟动物体内的生理环境使细胞在体外分裂增殖的一种技术。 原代培养：是指将机体取出的细胞或组织进行培养，在首次传代前的培养 传代培养：是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。天然培养基 : 直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液。 中空纤维：是一种细微的管状结构，表面在许多海绵状的多孔结构，类似动物的毛细血 管，内腔灌流培养液，外面接种细胞。 细胞株：是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由细 殖形成的细胞群，称细胞株。问答题1 试述动物细胞培养的特点。答：动物细胞比

2、微生物细胞大，无细胞壁。%1 动物细胞倍增时间长，生长缓慢。%1 培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。%1 动物细胞间主要以聚集体形式存在。%1 原代细胞一般繁殖 50 代左右即退化死亡。%1 动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还 需要血清。%1对于培养环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等。%1 细菌、真菌、病毒、支原体均可导致动物细胞培养物的污染。%1 绝大多数哺乳动物细胞只有贴附在固体或半固体的表面才能生长。2 贴壁培养的动物细胞按形态可分为几种类型？答：大致分为四种类型： 成纤维型细胞：与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不

3、规则形，细胞贴壁后呈长 形，胞质外伸出 2-3 个长短不同的突起。起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为这 式。上皮型细胞：类似上皮细胞的细胞，扁平状，较为规则，呈三角形及不规则扁平的多角形。 源于内胚层与外胚层的细胞在体外培养时都可能呈现上皮型。游走型细胞：细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，贴附于支持物上分散生 长，一般不连接成片。单核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细胞在体外培养常呈现此种形态。 多形型细胞：形态上不规则，一般分胞体和胞突两部分，最常见的是指神经元和神经胶质细 胞。3 试述动物培养基的种类和各自和特点。 答：天然培养基：有血清、血浆、组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）和

4、水解乳蛋白。 合成培养基：根据细胞生存所需的物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的，主要成分是 基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质，有利于标准化生产，组分和含 对固定，成本低。但缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要，因此需要补充一无血清培养基：由基础培养基和添加成分（细胞外基质、生长因了、结合蛋白与转运蛋白、酶抑制剂等）组成，保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性。减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序，但是无血清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。不同细胞株，所需补加物也不同。4 培养动物细胞所用灭菌方法有些？各适用于哪些用品“答：物理灭菌法： 紫

5、外线消毒：用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培 养 皿、培养板等。一般要照射30min 以上，这是常使用的消毒方法之一湿热灭菌：此方法也称为高压蒸汽灭菌，是适用面广、最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如 Hanks 液、 PBS 等）。灭菌条件是 121°C, 30min 过滤除菌：包括两方面一是用超净台对操作空间的空气除菌；二是用滤膜对培养用液和各种不能高压灭菌的溶液（如抗生素、激素、酶液、血清的灭菌。以0. 22 U m 滤膜除菌最 为常用。火焰灭菌：用于玻

6、璃吸管、培养瓶口的灭菌。化学消毒法：70%（或 75%）酒精（卫生级）：最常用的化学表面消毒剂, 用于手和一些金属器械或工作台面或物体表面的消毒。0. 5%过氧乙酸：是强效消毒剂 ，10 min 即可将芽抱菌杀死。用于各种物品的表面消毒， 用喷撒 和擦拭方式进行。5 试述动物细胞原代培养的方法。答：（一）组织块原代培养1、处死动物，取材分离2、组织剪碎（ 1mm3）3、冲洗、离心4、接种、培养5、常规检查（细胞形态活力、营养、pH 及污染）（二）细胞原代培养1、取材分离，组织剪碎2、消化液（常用胰酶）消化3、过滤离心分离、计数4、接种、培养5、常规检查6 试述动物细胞传代培养的方法答：悬浮生长

7、细胞传代离心法传代：离心 转/ 分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除 1/2-2/3, 然后用吸管直接吹 打形成细 胞悬液再传代。半悬浮生长细胞传代 （Hela 细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进 行 传代。贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液为 0.25%的胰蛋白酶液。7 培养动物细胞的微载体应具备哪些特点？答：良好的生物相容性，无毒无害；%1 有好的黏附性，一般带正电荷；%1 大的比表面积，颗粒均匀，孔径均一；%1 良好的传质性能；%1 强的机械性能；%1 好的热稳定性

8、。8 试微载体培养细胞的步骤。答：选择合适的微载体类型：比较几种不同的微载体的细胞贴壁率、细胞容纳量、微载体用量、搅动速度等，选择合适的微载体。%1 浸泡水化及消毒；%1 接种：根据细胞类型决定接种浓度；%1 培养观察与细胞记数；%1 消化与细胞回收：传代培养或收获细胞均需使细胞脱离微载体，通常采用酶消化法。%1 细胞收获：采用分组离心沉降收获细胞；%1 传代培养：如果做放大培养，可在细胞脱离微载体后，加入一些新的微载体以增大培养面 积。9多孔微载体具备哪些优点？答：易固定化；%1 大的比表面积保证细胞充分的生长空间；%1 细胞免受机械损伤，同时又可以提高搅拌强度和通气量，强化传质；%1 不仅

9、能培养贴壁细胞，也适合于悬浮细胞的培养；%1 内部具有网状结构的小孔，因此能使细胞在其内部生长，可降低血清用量。10 动物细胞培养的生物反应器应具备哪些特点？答：混合系统设计应能提供均匀、温和的混合状态，剪切力小，保证良好的传质效果；%1 反应器内空间利用率高，选用合适的载体系统和材料；%1 能严格保证无菌环境；%1 能精确地控制温度，酸碱度、溶解氧和二氧化碳浓度等条件；%1 能够方便、快捷地实现培养液的连续添加、样品的采样和观察。11 目前动物细胞大规模培养主要存在哪些问题？ 答：氨离子：来源一培养基与细胞代谢影响一抑制细胞生长 措施一防止培养基中的 Glu 的自然分解并尽量除 去培养基中的

10、氨乳酸：由糖代谢产生，抑制细胞生长 降低培养基中葡萄糖的浓度并平衡葡萄糖和 Gin 的比例二氧化碳：细胞产生 CO2 的速率大于通气去除的速度，由此对细胞产生影响控制通气，及时去除 CO2 甲基乙二醛：细胞代谢产物，对细胞有潜在的控制培养基中葡萄糖的浓度 渗透压：渗透压的升高有利于抗体的分泌加入渗透保护剂减小高渗对细胞生长的抑制作用载体：采用多孔载体减小对细胞的损伤细胞凋亡：是培养后期细胞死亡的主要原因解决方法：降低细胞营养成分的消耗和代谢毒物的产生，改善培养工艺，原癌基因 (bcl-2) 的导入，参数控制完善在线监控的技术APH- 氨基糖昔磷酸转移酶 DHFR 二氢叶酸还原酶 HPH- 潮霉

11、素 B 磷酸转移酶 TK- 胸腺口密喘核昔激 酶GPRT-黄瞟吟鸟瞟吟磷酸 核糖转移酶12 动物转染 (转基因 )细胞筛选中常用的选择性标记基因有哪些 ? 答：遗传标记编码产物 筛选药物 作用机理G418APH 灭活 G418氨甲喋吟DHFR 变体抗氨甲喋吟潮霉素 BHPH 灭活潮霉素B氨基喋吟TK 合成 TMP氨甲喋吟HGPRT 合成 GMP13 试述动物细胞活力测定的方法。 答：台盼蓝法测定活力活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表不细胞活力 的同时可完成计数。MTT 法 (四卩坐盐 (MTT) 商品名为糜卩坐蓝 ) 四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四卩坐盐还原成

12、不溶干水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚矶(DMSO)能溶解沉积在 细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的 formazan 量成正比。再用酶标仪测定 OD 值。 测定细胞相对活力。MTT 法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。14 如何进行动物细胞的冻存与复苏？ 答：冻存方法1) 预先配制冻存液：含 10%20%血清的培养基 +10% DMSO 或甘油2) 取对数生长期细胞，经胰酶消化 (或离心 )后，加入适量冻存液，制成细胞悬液(1X10 6- 5 XIO* 5 细胞 /ml)3) 加入 lml 悬液于冻存

13、管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4) 冷冻 复苏方法(1) 从液氮中取岀冷冻管，迅速投入 37-38 C水浴中，使其融化(1分钟左右)。(2) 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。(3) 低速 (800-1000rpm) 离心 10 分钟。(4) 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。每日观察细胞生长情况，若死细胞较多, 次日应换液。第十二章杂交瘤技术与单克隆抗体名词解释：杂交瘤技术 : 将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通称为杂交瘤技术。单克隆抗体：经过免疫的哺乳类动物单

14、一的 B 淋巴细胞可以分泌单一性抗体，这种具有 特异性 的、同质性的抗体为单克隆抗体。? HAT培养基：H:次黄口票吟(hypoxa nth in e), A:氨甲蝶吟(ami nopteri n,) T:胸腺口密 喘核昔 (thymidine) 取三者第一个字母称为 HAT 培养基。问答题1 试述用杂交瘤技术制备单克隆抗体的过程。答：细胞融合将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1： 10 或 1： 5 的比例混合在一起，在 37°C 水浴中边摇边加 50% PEG, 用不含血清培养液终止融合，离心沉淀细胞。杂交瘤筛选细胞液用 HAT 培养基悬浮，加入到含饲养细胞的培养板，3TC、 5%CO2

15、培养，每 3-4d 更 换HAT 培养基。15d 后改用 HT 培养液维持培养三周改用一般培养液8-12d 进彳丁抗体检测2 试述 HAT 培养基筛选杂交瘤细胞的原理与过程。答：原理： 融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT /TK- 细胞株，在 HAT 培养中不能合成DNA?融合所用的脾细胞是 HCPRT+ 和 TK+ 细胞株，能通过补救途径合成 DNA, 但不能长期生存。 只 有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在 HAT 培养基中通过补救途径合成 DNA ，又 能长期 存活与繁殖。过程：正常途径：糖、氨基酸 一? 核昔酸 ? DNA, 可以被氨基蝶吟阻断补救途径核昔酸前体一亥昔酸

16、一 ? DNA, 需要次黄瞟吟鸟瞟吟磷酸核糖转移酶（HGPRT ）和 胸腺口密噪 核昔激酶 （TK ）两种酶的参与。3 试述人源性单克隆抗体的种类及各自的特点。 答：人一鼠杂交瘤单克隆抗体：融合方法基本与鼠一鼠杂交瘤相同。亲本骨髓瘤细胞是小鼠 骨 髓瘤细胞，亲本 B 细胞则来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但是，人一鼠杂交瘤的人单克隆抗体分泌性能很不稳定，多数情况下杂交瘤会很快失去抗体分泌能力。人一人杂交瘤单克隆抗体 : 可通过建立人骨髓瘤或其他人细胞系与人淋巴细胞融合来制备人单克隆抗体。人源性融合亲本细胞需具有较高的融合率、产生的杂交瘤核型稳定并能产生一定量的具有特异性的抗体等特征

17、。人一人杂交瘤核型稳定，然而遗憾的是可供利用的人类骨髓瘤细胞种类非常有限。严重免疫缺陷小鼠制备人源化单克隆抗体：将人免疫干细胞移植到 SCID （联合免疫缺陷） 小 鼠体内， SCID 小鼠实际上获得了人的免疫系统。基因工程单克隆抗体：基因工程抗体是通过分子技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当 载 体重组后引入不同表达系统所产生的抗体。可以获得完全人源化抗体。第十三章体外受精与核移植动物名词解释：胚胎工程 : 是指对动物早期胚胎或配子进行的工程技术操作，获得所需要的成体动物的技术。 体外受精：哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。胚胎移植：是指将发育到一定阶段的胚胎移

18、植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受 体”母畜输卵管或了宫的技术。 试管婴儿：是指卵子与精子在体外受精，培养发育成早期胚胎，再植回受体子宫内发育出 生的 婴儿。核移植动物：又称克隆动物 : 用特定发育阶段的核受体体外构建重组胚，通过胚胎移植到受体完成发育出生的动物。包括胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物。胚胎融合：又叫胚胎嵌合，是将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌合体后代的技术。第三代试管婴儿：通过种植前遗传学诊断 （PGD） 技术培育出的试管婴儿将被称为第三代 试 管婴儿。问答题1 试述体外受精动物培育的步骤答：精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养；%1 体外受精；%1 重组胚激活与体外培养；%1 胚胎移植；%1 体内发育、出生。2试述试管婴儿的培育流程。答：女方超排卵与取卵 精子采集与体外获能处理 体外受精 受精卵体