分子生物学综述1

1、分子生物学综述肌萎缩侧索硬化症的基因分析和基因治疗进展姓名：胡莉琴学号：416522811456专业：神经病学单位：南昌大学医学部肌萎缩侧索硬化症的基因分析和基因治疗进展ABSTRACT:OBJECTIVE: Explore amyotrophic lateral sclerosis in the virulence genes and gene therapy are reviewed.DATA SOURCES: An computer-based online search of Pubmed database was undertaken to indentify articles pu

2、blished in English between 1993 and 2011 by using the keywords of “amyotrophic lateral sclerosis,gene,gene therapy” Chinese relevant article published from 2005-2011 were searched with computer in WEI PU.STUDY SELECTION；The data were checked firstly, the articles on amyotrophic lateral sclerosis wer

3、e collected. Inclusive criteria: Research amyotrophic lateral sclerosis of virulence genes; Amyotrophic lateral sclerosis gene therapy research. Exclusive criterial:Drug therapy; repetitive studies and experiential and individual literature report.DATA EXTRACTION: Totally 116 articles in all on amyo

4、trophic lateral sclerosis were collected ,of which 32 articles were selected.DATA SYNTHESIS: The pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis and SOD1 gene mutations may be relevant. When SOD1 genetic change, its code of protein conformation also produces change, enzyme activity reduced, scavenging

5、 free radicals ability. In amyotrophic lateral sclerosis gene therapy, neural factor can promote motor neuron in the survival and growth and repair, iRNA can delay the motor neuron degeneration of the development.CONCLUSION: For amyotrophic lateral sclerosis to explore its pathogenesis, for ALS gene

6、 therapy to lay the foundation, thus heal ALS.KEYWORDS: amyotrophic lateral sclerosis ;gene; gene therapy摘要：目的： 探讨肌萎缩侧索硬化症在致基因和基因治疗方面的研究进展。资料来源：应用计算机检索Pubmed1993-2011年的文章，检索词为“amyotrophic lateral sclerosis,gene,gene therapy”,限定语言种类为中英文，同时计算机检索维普数据库2005-2011年期间的相关文章。资料选择：对资料进行初审，选取有关肌萎缩侧索硬化症方面的研究。纳入选

7、标准：1.研究肌萎缩侧索硬化症的致病基因等方面的研究。2肌萎缩侧索硬化症的基因治疗的研究。排除标准：1.药物治疗的研究。2.重复研究及经验和个人报告文献。资料提炼： 共检索到116篇关于肌萎缩侧索硬化症致病基因及基因治疗等研究的文献，入选32篇。资料综合： 肌萎缩侧索硬化症的发病机制可能和SOD1基因突变有关。当SOD1基因发生改变时，其编码的蛋白质构象也发生变化，酶活性减低，清除自由基能力下降。在肌萎缩侧索硬化症的基因治疗方面，神经因子可以促进运动神经元的存活和生长及其修复，iRNA可以延缓运动神经元的变性发展。结论：对于肌萎缩侧索硬化症要不断探索其发病机制，为ALS的基因治疗打下基础，从而

8、治愈ALS。关键词：肌萎缩侧索硬化症;基因；基因治疗0 引言肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是运动神经元病的主要类型，以脊髓前角和脑干运动神经核的运动神经元以及锥体束的慢性进行变性，上下运动神经元同时受损为特征。男性患者多见，一般在4050岁起病，发病后35年死亡。主要表现为脊髓和脑干所支配的肌肉无力、萎缩、肌束震颤、球麻痹和锥体束征；感觉系统一般不受累。目前ALS的病因和发病机制不明，也无特效治疗。而分子生物学研究的迅速发展为ALS提供了新的治疗策略。本文就近年来关于ALS的基因突变和基因治疗的研究进行了综述。1.新致病基因的发现和遗传学

9、研究的进展SOD1基因突变与ALS有关已经被公认，在散发病例中占1%-4%，在家族遗传病例中占20%左右。在家族ALS中是否存在其他的基因突变一直是学者们研究的重点。美国的Brown对16个没有SOD1基因突变的常染色体显性遗传的ALS家族进行基因连锁分析，发现第16号染色体至少有3个新的突变位点，还提出16%的ALS患者可检测到SMN2基因。 家族性的ALS(FALS)分12种亚型：ALS1-ALS8、合并ALS的额颞叶痴呆综合征、X性连锁遗传的ALS、ALS痴呆帕金森综合征、进行性下运动神经元病等1。在不同的人群，约12-13%FALS和2%-7%的散发性ALS（SALS）患者有铜锌超氧化

10、物歧化酶（SOD1）基因突变2。国内李晓光等发现FALS的E133V和H46R基因突变位点；在AL中，发现了V29A、N861和V47A突变位点。樊东升等发现作为本病易感基因的VEGF启动子区多态分布与欧美白人不同，且在中国人群中发现VEGF启动子区多态分布与起病年龄明显相关3。目前还发现3个与FALS相关的基因，ALS1基因的SOD1，ALS2基因Alsin和ALS4基因Senetaxin。中国目前尚未见一个FALS位点报道，仅发现1例SOD1突变4，提示中国ALS具有与西方不同的发病机制，有不同的基因导致中国FALS的发生。2 SOD1基因突变的特点SOD1基因组DNA长12kb，含有5个

11、外显子编码153个氨基酸，组成33ku的金属酶蛋白，具有清除自由基和抗氧化的功能。在FALS患者中，SOD1基因的2号外显子编码区发生插入突变导致mRNA的转录提前终止，使翻译至第36号密码子时遇到终止密码子TAA，从而使SOD1蛋白质翻译提前终止。正常的SOD1蛋白由153个氨基酸组成，而突变后的SOD1蛋白质为35个氨基酸组成的短肽。新突变的SOD1二级结构基本上保持了野生型SOD1中对应区域的二级结构，但改变了SOD1蛋白结构的整体活性，导致突变的SOD1蛋白的抗氧化损伤作用减弱，自由基产生增多，使细胞膜、线粒体、轴突受损，影响轴浆运输5、6。3 基因治疗3.1 神经营养因子的治疗 随着

12、对ALS研究的不断深入，神经营养因子在ALS 治疗中的作用逐渐受到重视，如睫状神经营养因子（CNTF）、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、脑源性神经营养因子（BDNF）以及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等。多项研究表明，CNTF可延缓Wobbler小鼠疾病的发展，减少肌萎缩，促进运动神经元存活和生长7、8，但临床结果不满意9、10。研究表明，IGF-1可以促进神经元修复，增加损伤后脊髓运动神经元的存活率11。Sakowsk等通过对ALS患者进行IGF-1治疗后发现，它可以延缓ALS的进展且对身体无副作用【12。但最近一项研究表明，皮下IGF-1治疗并不能延缓ALS疾病的进展13。BND

13、F 在大脑神经元及胶质细胞中合成，可以明显增大神经元胞体和促进轴突的生长。体外研究证实，100ng/ml的BDNF可有效地促进胆碱乙酰转移酶免疫反应性运动神经元的存活14。GDNF不仅促进正常运动神经元的存活、降低细胞凋亡中自然发生的神经元死亡，还对受损的运动神经元具有营养保护作用。GDNF的神经营养保护作用比BDNF高75倍，比CTNF高650倍，是目前发现的活性最强的运动神经元神经营养因子。Mohajen等发现GDNF还能促进运动神经元存活和生长15。Storkebaum16将基因重组的VEGF经脑室内注入到ALS大鼠体内，发现治疗鼠的发病时间和生存期分别延长17d和22d。但对人类ALS

14、的治疗试验尚在进行中，需进步观察其疗效和副作用。3.2 抗凋亡的基因治疗细胞凋亡是ALS等的标志之一。对进行性运动神经元病（PMN）的模型，转入表达抗凋亡的Bcl-2或胶质细胞源性的神经营养因子基因可预防运动神经元的凋亡，但对动物的生存期没有影响。Anna等研究者17将PMN小鼠与带显性突变Wlds基因的小鼠杂交，产生的PMN/Wlds鼠状和生存期较PMN小鼠有一定程度改善，推测可能与Wlds基因产物减轻PMN小鼠逆向转运缺陷有关。3.3 RNA抑制基因表达的治疗 2001年出现的RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）,又称基因沉默技术，是通过破坏细胞源性mRNA来阻止相

15、应基因表达，保护细胞免受病毒和其它遗传因子的影响。Maxwell等18 的研究提示,在体外培养的小鼠成神经细胞瘤细胞 中稳定表达的人突 变SOD1使细胞对细胞毒的刺激( 环胞菌素- A) 很敏感，当用RNAi特异性减少突变SOD1表达时，可有效对抗环孢素-A引起的细胞死亡。Ralph和Raoul等19、20利用设计的一种慢病毒载体携带特异性抑制突变SOD1的RNAi，并将其注入ALS模型鼠的肌肉或脊髓内。检测证实动物体内突变SOD1的表达显著减少，脑干和脊髓中运动神经元的存活率明显提高，同时可以有效的提高ALS模型鼠的运动能力以及延长其寿命。Xie等的研究结果提示，靶向抑制前列腺凋亡反应基因4

16、（Par-4）可能对变性运动神经元具有神经保护作用。Par-4来自脊髓前角的突触小体和后突触致密区，可能是导致运动神经元变性的级联事件中的一个关键性环节。利用RNAi技术降低Par-1表达，可减低由突变SOD1引起的突触小体处caspase-3活性和线粒体障碍，从而减缓神经元变性的发展。3.4 其它 最近发现ALS患者有编码神经丝重链(NF-H)的基因突变，因此利用腺病毒载体介导人类神经丝轻链(NF L) 基因可以治疗过度表达NF- H鼠，其发病和生存期平均延长了6周左右。由于神经丝轻链对神经丝重链介导 的ALS发病有保护作用，故推测其也可能具有一定的治疗作用21。Jiming认为如果NF水平

17、增加出现在神经元的胞体内而不是轴突等处，可缓解ALS。并推测N F蛋白能减低运 动神经元中突变SOD1蛋白的毒性，原因可能是大量NF蛋白形成了一个有效的蛋白池来吸收氧自由基等毒性物质， 而避免后者对其他细胞器的损伤。4 结论 由于ALS发病机制可能涉及突变SOD1的“获得毒性”、兴奋性氨基酸毒性、线粒体障碍、轴突运输障碍、氧化损伤及细胞凋亡等方式，因此有效的ALS治疗策略应尽可能的兼顾多方面，且将副作用减到最低限度。从理论上讲，致病基因的分析能够为我们进一步认识疾病的病因学、摸清疾病的发病机制、阐明疾病的病理生理过程和开发药物治疗新靶点提供线索， 从而解决ALS在诊疗方面所带来的诸多困惑。近年

18、来，尽管基因治疗方法的基础研究取得了一定成绩，但离临床应用还有很大距离。当前，ALS的临床治疗应以提高其生存率，缓解其痛苦为标准，不断提高基因诊疗技术，使ALS患者得到早期诊断、早期治疗，延长患者寿命，提高患者生活质量，尽可能治愈ALS。5.参考文献1. Kunst C B.Complex genetics of amyotrophic laterl scerosis J.Am J Hum Gener,2004,75:933.2. Voterra A ,Trotti D,Tromba C,ct al.Glutamate uptaker inhibition by oxygen free rad

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