丙型副伤寒沙门菌的灭活工艺.docx

1、论著丙型副伤寒沙门菌的灭活工艺陈国怀，刘大东，高鸿飞，金红燕，罗广，席仲兴兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：目的优化甲酸对灭活丙型副伤寒沙门菌原液的条件，确定灭活工艺参数。方法在37Y条件下，比较不同甲醛浓度、灭活时间对丙型副伤寒沙门茜原液的灭活效果，依据无菌检查、外观以及效价测定的结果，确定丙型副伤寒沙门菌原液的灭活工艺参数，并对该工艺进行细菌灭活验证。结果不同菌株制成的丙型副伤寒沙门茜液,当稀释至一定浓度(】000x10*cfu/mL)后.采用终体积分数为1%的甲酵溶液，经37Y灭活48h,可达到完全灭菌的效果，同时维持了抗原的稳定性。结论

2、经过条件优化，确定了丙型副伤寒沙门曲灭活的工艺参数,完善了关键技术。关键词：甲醛溶液;丙型副伤寒沙门菌;无菌试验;灭活工艺中图分类号：R378.2U文献标志码：A文章编号：1005-5673(2015)02-0012-8DOI：10.13309/ki.pmi.2015.02.004InactivationprocessforsalmonellaparatyphoidCCHENGuo-huai,LIUDa-dong,GAOIlong-fei,JINHong-yan,LUOGuang.XIZhong-xingInnzhoiLInstituteofRiologicalProduclsCo,lid,C

3、enterfarGansuPrtnincialVaccineEngineeringresearch,Lanzhou730046,GansuProvionce,ChinaCorrespondingauthor-X!Zhong-xing,E-mail:xiyue8342181Abstract：ObjectiveTooptimizetheconditionsininactivationofsalmonellaparatyphoidCbulkwithformaldehydesolution,anddeterminetheparametersoftheinactivationprocess.Method

4、sTheinactivationeffectsofsalmonellaparatyphoidCbulkfromdifferentconcentrationofformaldehydesolutionanddifferentinactivationtimewerecomparedat37XI.parametersoflheinactivationprocessweredeterminedaccordingtotheresultsofappearance,sterilityandliterlest,andthevalidationforbacteria)inactivationwascarried

5、out.ResultsSalmonellaparatyphoidCbulkdilutedtoacertainconcentration(<1000x0Hcfu/mL),inactivatedbyformaldehydesolutionatafinalconcentrationof1%(V/V),andincubatedat37Yfor48h,thebulkcouldbeachievedacompletesterilization.andpreservedantigeicityinstable.ConclusionAfteroptimization,theparametersininact

6、ivationprocessofsalmonellaparatyphoidCweredetermined,andthekeytechniquewasimproved.Keywords：Formaldehydesolution；SalmonellaparatyphoidC;Sterilitytest；Inactivationtechnology肥达氏反应(Widtdagglutinationtest,WAT)是一种辅助诊断肠热症(伤寒、副伤寒)的凝集反应，而各型诊断菌液是肥达氏试剂中不可或缺的组分之一。针对目前时有发生的丙型副伤寒口辿，其快速确诊则需要丙型副伤寒菌诊断菌液。在制备诊断菌液时,对投

7、产抗原有严格的质址要求。在灭活过程中,一般丙型副伤寒成原液比较伤寒菌、甲型副伤寒慎和乙型副伤寒菌容易发生自凝现象。其抗原的凝集原性达不到标准，无形中增加了工作负担和生作者简介:陈国怀，医学生物学工程师，主要从事体外诊断试剂生产和检定工作。通讯作者:席仲兴,E-mail:xiyue8342181产成本。良好的灭活工艺，既能完全灭活细菌，乂能保持抗原良好的凝集原性。因此,完善灭活工艺，成为生产中迫切需要解决的关键性问题。通过相关的试验，选择出适合于灭活丙型副伤寒菌的技术参数。1材料与方法1.1菌种丙型副伤寒沙门菌菊株号为CM-CC50306,来源于中国食品药品检定研究院，由兰州生物制品研究所有限责

8、任公司保管。1.2主要试剂及仪器甲醛溶液(Formaldehydesolution)、磷酸二氢钠、磷酸狙二钠和氯化钠均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；注射用水、基础培养基、增菌培养基、营养琼脂斜面和硫乙醇酸盐均由兰州生物制品研究所有限责任公司培养基室提供;丙型副伤寒沙门菌质控品、。.9%氯化钠溶液、磷酸盐缓冲盐水（pH7.0PBS）、1%甲醛PBS均由兰州生物制品研究所有限责任公司诊断用品室提供；AL104-IC型梅特勒-托利多电子天平，购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;PHSJ-5型pH计，购自上海雷磁精密仪器有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱，购自上海一恒科学仪器有

9、限公司;G24N恒温振荡器，购自NEWBRUNSWICKSCIENTIFIC公司。1.3丙型副伤寒茵原液的制备将菌种开启活化,经基础培养基37T培养18h,经革兰染色镜检、生化试验与血清学试验系列检定均合格后，作为供试菌。选择光滑型菌落3株，分别用基础培养基扩种，37T培养18h,收集新鲜函苔于一定体积的PBS中,制成一定浓度的丙型副伤寒笛原液，批号分别是R-20120601、R-20120602、R-20I20603o丙型副伤寒菌应用液的制备以PBS将甲醛配制为1%溶液，分别将收集的新鲜菌苔稀释为1000X108cfu（曲落）/mL的应用液,对应批号分别为D20120601、D2012060

10、2、D20120603。1.4 灭活试脸1.5.1甲醛灭活条件的选择分别量取3份丙型副伤寒菌原液和3份丙型副伤寒菌应用液,用绸布过滤后，加甲醛溶液分别为菌液量的1.0%、1.3%、1.5%,对菌液进行灭活试验。1.5.2原液和应用液处理先用恒温振荡器，150r/min,3h,使菌液分散成菌悬液，于37乞灭活后静置。在灭活36h、48h、72h后，用常规方法取样，做无菌试验。取菌悬液5mL接种于含200mL培养液的增菌管中,35-37Y培养2天，分别以0.5mL移种于营养琼脂斜面及硫乙醇酸盐培养基（不含琼脂）各1管，30-35幻培养5天，观察有无细菌生长，以确定菌液灭活效果。1.5.3灭活效果的

11、外观检查对灭活后的丙型副伤寒菌原液和应用液做物理性状的外观检查。1.6效价测定使用无菌试验合格和外观正常的丙型副伤寒菌应用液，用PBS将其稀释成7X108cfu/mL,用丙型副伤寒菌质控品做效价测定。1.7综合试验用PBS将丙型副伤寒菌应用液稀释成70xl08cfu/mL,无菌分装于安甑中，分别进行37T加速试验，批号为20120701、20120702、20120703。7天后进行外观检查，无萌试验和效价测定。放置于2-8r作稳定性试验,18个月内；以常规留样观察法,按期做外观检杳，无菌试验和效价测定。2结果2.1甲醛灭活丙型副伤寒菌原液和应用液的外观检查通过试验可知，同型的不同萌株对甲醛火

12、活比较敏感，在37终体积分数为含1.0%甲醛溶液作用72h,丙型副伤寒菌原液容易发生自凝现象。可能是甲醛作用于细菌后，丙型副伤寒菌细胞通透性和胞浆胶体发生变化,从亲水状态变为厌水状态，引起其生物活性的改变。用含1%甲醛的PBS,稀释成浓度为lOOOxlO8cfu/mL的应用液，经37T灭活72h,外观合格，见表1。表1甲醛灭活内型副伤寒菌原液和应用液的外观效果Tab.1AppearanceofbulkandapplicationsolutionfrominactivatedsalnutnellaparatyphoidCbyformaldehydesolution批号灭活温度（Y）甲醛体积分数（

13、%）灭活时间（h）物理性状R-2012060137J.072前悬液R-20120602371.072凝集R-20120603371.072凝集D-20120601371.072菌悬液D-20120602371.072菌悬液D-20120603371.072菌悬液2.2丙型副伤寒茵原液和丙型副伤寒菌应用液的副伤寒菌原液，经终终体积分数为含1.5%的甲醛灭活效果无荣试验结果显示：用PBS收集的丙型溶液,37勾灭活处理72h后，无菌试验不合格，可能是由于细菌浓度高，150r/min,3h摇荡，不能使菌PBS,将丙型副伤寒菌菌苔应稀释成浓度为10（）0x液充分分散为均匀的细菌悬液，致使甲醛未能完全&q

14、uot;cfu/mL的应用液。经37°C48h灭活后，无萌作用于悬液里的细菌。应用体积分数1%甲醛的试验合格，见表2。表2甲醛对内型副伤寒曲原液和应用液的灭活效果Tab.2TheefleetfromformaldehydesolutioninactivationonsalmonellaparatyphoulC菌液批号灭活温度灭活时间甲醒体积分数（%）（龙）(h)1.01.31.5R201206013736+48+72+R201206023736+48+72R201206033736+48+72+D201206013736+.4872D201206023736+48721)201206

15、033736+4872注:“+”表示有筋生长,“-”表示无菌生长。2.3甲酷灭活丙型副伤寒菌的抗原性测定丙型副伤寒菌抗原效价是丙型副伤寒菌抗原与其对应的抗体凝集能力的一种表现方式，稀释后的内型副伤寒曲溶液含1%的甲醛,37勾灭活48h后，效价N1：1600；37无灭活72h后，效价N1:800。这样处理适合于半成品的生产，见表3。表3甲醛溶液对内型副伤寒菌应用液抗原效价的影响Tab.3Theeffectstoantigentiterofsalmonellataralypho讯Cfromfonnaidehydesolution稀释批号灭活温度（Y）甲醛体积分数（%）灭活时间（h）抗原效价D201

16、20601371.048>1：16001.072>1：8001)20120602371.048>1：16001.072>1:800D20120603371.048>!：16001.072>1:8002.4丙型副伤寒菌应用液的综合试验以PBS稀释灭活后的应用液,浓度为70X108cfu/mL菌液，经过37Y7天的加速试验和28T的18个月的保存试验，外观检查和无菌试验均合格，效价略有降低，但在正常范围之内，试验的综合指标是合格的,见表4。Tab.4表4甲醛溶液对内型副伤寒函液的综合影响Thecomprehensiveeffectfromformaldehyde

17、solutioninactivatedforsalmonellaparatyphoidC批号37T（7天）28r（J8个月）无菌试验外观效价无询试验外观效价20120701合格萌悬液1:400合格菌悬液N1：40020120702合格菌悬液1:400合格菌悬液N1:40020120703合格菌悬液1:400合格菌悬液:4003讨论按照“伤寒，副伤寒及变形菌0X19.0X2和OXK诊断菌液制造及检定规程”（中国生物制品规程2000年版）要求，取菌苔用PBS稀释成适宜的浓度，以绸布过滤，按菌液量的0.5%1%加入甲醛溶液杀菌，于35-37勾放置23天。据此做了3批次菌液原液的灭活试验,其灭菌效果均

18、不合格，有的外观不合格。甲醛溶液可使丙型副伤寒菌原液中的鞭毛蛋白局部凝聚或变性；如甲醛溶液含量和灭活温度控制不当，将会影响产品的质量。因此，既要完全灭活，乂要维持抗原效价的稳定性,这是生产中所要把握的技术要点。在外界各种理化因素影响下，生物会发生遗传和变异。大多数沙门菌为光滑型（S）,具有特异性多糖侧链，当细菌表失这种特异性多糖后，变为粗糙型（R）。在制备丙型副伤寒菌诊断菌液原液时，一般投入体积分数为1%的甲醛溶液经48h灭活后，就会发生白凝现象。不利于丙型副伤寒菌原液的完全灭活和凝集原性的稳定。考虑在实际规模化生产中，制备原液的菌苔量是从多个克氏培养瓶中合并收集的，因收集菌苔量和培养基的批间差,各批次原液菌浓度不易