人心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备及定量检测试剂盒的研制.docx

1、,论著人心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备及定量检测试剂盒的研制彭林峰，袁皓加，席仲兴，张正雷，罗广，潘宪云，路东，金红燕，陈国怀（兰州生物制品研究所有限夷任公司，甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州730046）摘要：目的利用抗心肌型脂肪酸结合蛋白单抗，研制定鼠检测心肌型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的EL1SA试剂盒。方法使用基因重组H-FABP免疫小鼠,以杂交瘤技术制备特异性抗H-FABP单抗，用这些单抗研制定量检测H-FABP的EUSA试剂盒。结果筛选获得2株稳定分泌抗H-FABP单抗的杂交痛细胞株,研制了定量检测H-FABP的EL1SA试剂盒，灵敏度达到0.2ng/mL,线性范围0.4

2、-25nmL,r2=0.9967,回收率在97.2%-104.5%,精密度的变异系数（CV）W6.72%;应用此试剂食检测健康人血浆H-FABP,含量为1.878.50ng/mL。结论所研制的EUSA试剂盒有较好的灵敏度及特异性，可用于人血浆中H-FABP含虽的检测。关键词：心肌型脂肪酸结合蛋白；单克隆抗体（单抗）；酶联免疫分析中图分类号：Q81文献标志码：A文章编号：1005-5673（2013）05-0023.3PreparationofmonoclonalantibodyagainstH-FABPanddevelopmentofaquantitativeELISAkitindetecti

3、onofH-FABPPENGLin-feng,YUANHao-jia,XIZhong-xing,ZHANGZheng-lei,LUOGuang,PANXian-yun,LUDong,JINHong-yan,CHENCuo-huai(LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Lid.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Ijanzhou750046,China)Abstract：ObjectiveTopreparemonoclonalantibodyagainsthumanheart-type

4、fattyacidbindingprotein(H-FABP)andtoestablishaquantitaliveELISAKitindetectionofH-FABP.MethodsItwasbyimmunizationofmicewithrecombinantH-FABP,andcellfusionwasprocessedtoestablishhybridomacelllines,thespecificmonoclonalantibodiesagainstH-FABPwereprepared.ResultsThequantitativeELISAindetectionofH-FABPwa

5、sdevelopedbyusingthesemonoclonalantibodies.Thesensitivityofthisassayreachesto0.2ng/mL,andthelinearrangeisin0.5-32ng/rnLwithr2valueof0.9967andrecoveryratesarein97.2%-104.5%,theCVofprecisionislessthan6.72%.ItcanmeasureH-FABPlevelinhealthyhumanplasmainconcentration1.87-8.50ng/mL.ConclusionThedevelopedE

6、LISAkithasbettersensitivityandspecificity,whichcouldbeusedindetectionofH-FABPinhealthyhumanplasma.Keywords；Humanheart-typefattyacidbindingprolein(H-FABP);Monoclonalantibody(MeAb)；ELISA脂肪酸结合蛋白是一种相对分子质量为15000的小分子蛋白质，存在于机体多种组织细胞的胞浆中，主要担负着结合脂肪酸并调节其细胞内代谢的功能，按照组织特异性不同可分为心肌型（HFABP）、小肠型（I-FABP）、肝脏型（L-FABP）、

7、脂肪细胞型（A-FABP）、脑细胞型（B-FABP）、肾脏型（KFABP）、骨骼肌型（S-FABP）、牛皮癣相关型（PA-FABP）及表皮型（E-FABP）9种亚型。H-FABP较收稿日期：2O13-O7-Q5;修回日期：2013-08-19作者简介:彭林峰（1975-）,男，医学生物学工程师，主要从事诊断试剂生产和研发。通信作者：席仲兴，E-mail：xiyuc8342181。特异的存在于心肌细胞的胞质中，目前的研究发现其能够在心肌损伤的早期释放入血液，可作为心肌损伤的一种新的标志物用于急性心肌梗死（Acutemyocardialinfarction,AMI）的早期诊断近年来研究发现,H.F

8、ABP在AMI发生1.5h后就可出现在血浆中,6h达到高峰，随后逐渐下降，到24h后恢复到正常水平。而且,H-FABP对早期AMI的诊断敏感性显著高于cTnI（肌钙蛋白I）和CK-MB（肌酸激酶同工酶），其诊断发病3h内的AMI亦明显优于cTnI、CK-MB和MY0（肌红蛋白），表明H-FABP可作为早期急性心肌梗死的检测指标因此，定量检测血液中H-FABP的含量对AMI的诊断和治疗有重要意义。研究应用单克隆抗体技术，研制了定量检测H-FABP的ELISA试剂盒。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物BALB/C小鼠，812周龄，雌性，清洁级；F1代小鼠，10-12周龄，雌性，清洁级；均由兰

9、州生物制品研究所有限责任公司（简称兰州公司）实验动物室提供。1.1.2细胞小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0细胞由兰州公司诊断用品室保存。1.1.3主要试剂和材料次黄嗦吟、胸腺嗜喧核昔、组基蝶吟、聚乙二醇、二甲基亚根、兔抗鼠IgG酶标记物、兔抗鼠IgG亚类检测试剂、辣根过氧化物酶、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂和KPMI1640均购自Sigma公司；酶标板购自Nunc公司；小牛血清购自兰州民海生物制品公司；H-FABP参比品、洗液、显色液和终止液均由兰州公司诊断用品室提供;基质稀释液为含50mg/mL人血白蛋白的PBS缓冲液，由兰州公司诊断用品室提供。1.2方法1.2.1杂交痛细胞株的建立参照文献：6方

10、法。用纯化的基因重组H-FABP抗原免疫BALB/c小鼠，经4次免疫后，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,克隆化3次后得到6株分泌抗H-FABP单抗的杂交瘤细胞株。将上述细胞株扩大培养,冻存并制备腹水。1.2.2单抗特性鉴定单抗的腹水效价测定:采用间接ELISA方法;单抗Ig类及亚类检测:用鼠单抗分型试剂盒鉴定6株单抗的lg类与亚类，采用间接ELISA方法;单抗亲和力检测:采用硫景酸钾洗脱法；单抗识别抗原表位的检测:采用间接ELISA测相加指数，分析抗原识别位点，根据公式.4/=24w/（%+&）Tx100%判定结果,0值大于50%时，表示两种单抗所识别的抗原位点不同;4/值在10%-50%之

11、间时，表示两株抗体识别的抗原表位有差异值小于10%时，表示两种单抗识别的抗原表位相同或相近。1.2.3双抗体夹心ELISA检测试剂盒的研制包被抗体浓度与酶标记抗体最佳浓度的选择:选择效价高、亲和力强、识别不同抗原表位的两株单抗分别作为包被抗体和HRP标记的信号抗体。采用方阵滴定法确定最佳抗体包被浓度与酶标记抗体浓度;线性范围分析：配制H-FABP的梯度稀释液（050ng/mL），用试剂盒检测，以H-FABP浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制散点图，并进行线性分析，确定线性范围;准确性分析:用基质稀释液将H-FABP参比品稀释成0.5ng/mLx2ng/mL.8ng/mL、14ng/mL、20n

12、g/mL的样品，通过测定回收率，分析检测方法的准确性;灵敏度分析：配制质量浓度分别为0ng/mL.0.05ng/mL、0.1ng/mL,0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL的H-FABP溶液,每个浓度检测5次，计算0ng/mL的均值及标准差（SO），吸光度均值+3SO为阳性;特异性分析:分别检测0.1mg/mL胆红素、20mg/mL胆固醇、500mg/mL血红蛋白、0.5ng/inL肌钙蛋白，其浓度为人血清正常值的5倍，重复3次，计算阴性对照均值及标准差，吸光度均值+3S/）为阳性;检测方法的稳定性分析：将制备的试剂于36-38T放置6d后,对定最曲线中的部分

13、测定点进行检测，分析灵敏度、线性范围、变异系数等，与28幻保存的试剂进行对照;精密度分析：用基质稀释液配制25ng/mLJ5ng/mL、5ng/mL3个质量浓度的H-FABP溶液，每个浓度重复检测10次,计算批内精密度，使用不同批次制备的试剂，分别进行5次独立实验，计算批间精密度。1.2.4临床样本检测应用H-FABP定量检测试剂盒对357份健康人血浆中H-FABP含量进行测定，样本入选标准为：血脂、血压、血糖、肝肾功能以及心电图均正常，排除外伤、肌肉病变、心血管疾病、糖尿病和其他内分泌疾病，测定结果通过矩形正态检验，其95%正常参考值上限按X2SD计算，计算正常参考值。检测解放军总医院和解放

14、军第305医院住院及门诊就诊的AMI患者血清60份，入选标准为所有患者均经临床表现、心电图动态演变和心肌生化标志物检查确诊。2结果21杂交瘤细胞株的建立用纯化的的H-FABP抗原免疫BALB/c小鼠,血清效价达到1：10000时进行融合，融合率在95%以上。用间接ELISA法筛选出18个阳性克隆,阳性率为5%,对其进行3次克隆化培养后，获得6株可分泌高效价单抗的杂交瘤细胞株,经液氮冻存、复苏及3个月连续传代培养后，仍然可稳定分泌单抗。2.2单抗特性鉴定2.2.1单抗的腹水效价采用间接ELISA检测纯化后腹水抗体效价，各株单抗腹水效价均在lx105-1X106之间。2.2.2单抗Ig类及亚类4B

15、12、2G4、1A6分泌的单抗为IgG2a.7C8.8Dll分泌的单抗为IgG2b,5E10分泌的单抗为IgG3；轻链均为k链。2.2.3单抗的亲和力采用硫氤酸钾洗脱法，4B12、2G4、1A6、7C8、8D11、5E10等6种单抗的亲和力指数分别为2.2mol/L、3.0mol/L、3.2mol/L、2.8mol/L、2.6mol/L、2.0mol/L,抗体相对亲和力大小排列为IA62G47C88D114B125E10o2.2.4单抗识别的表位以位点加成试毁(间接ELISA)测定各株单抗4值，计算41值。单抗2G4与7C8A值为67.8%,识别不同抗原表位。2.3双抗体夹心ELISA检测试剂

16、盒的研制2.3.1包被抗体浓度与酶标记抗体最佳浓度的选择选择7C8、2G4经凝胶过滤(S-300)纯化后，分别作为包被抗体和HRP标记抗体,方阵滴定法确定7C8最佳包被浓度为4000倍稀释，HRP标记2G4工作浓度为5000倍稀释。2.3.2线性范围分析具有良好线性关系的检测区间为0.425ng/mL,H-FABP的浓度曲线方程为、=0.0898x+0.1338,尸=0.9967。见图1。图1H-FABP的ELISA系统的线性范围分析Fig.1ThelinearrangeofELISAsystemindetectionofH-FABP2.3.3准确性分析检测5份已知H-FABP质量浓度的样品，

17、其回收率在97.2%104.5%之间，表明该试剂盒有较高的准确性。见表1。表1准确性分析结果Tab.1Resultsforaccuracyanalysis已知浓度(ng/mL)测定浓度(ng/mL)准确度(%)0.50.4797.202.02.03101.508.08.14101.7514.013.7298.0020.020.90104.502.3.4灵敏度分析在系列稀释的参比品梯度中,0ng/mL的参比品均值+3SD为0.117,0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL参比品吸光值分别为0.091、0.102.0.158,0.2ng/mL参比品已成阳性反应，故该试剂盒的检测灵敏

18、度为0.2ng/mL。2.3.5特异性分析阴性对照A均值为0.095,SD为0.012,0.1mg/mL胆红素、20mg/mL胆固醇、500mg/mL血红蛋白、0.5ng/mL肌钙蛋白的检测A均值分别为0.098.0.092.0.102.0.097,均0.05),男女各组测定结果合并，均呈正态分布或近似正态分布。检测AM1患者血清60份，H-FABP质量浓度为(25.8土6.7)ng/mL。表3精密度分析结果Tab.3Resultsofprecisionanalysis已知浓度(ng/mL)XSI)sCVH-FABP浓度(ng/mL)5ng/mL15ng/mL15ng/mLXSDcv%XSDC

19、V%XSf)CV%批内4.870.174.2315.080.234.7225.240.584.85批间4.920.236.1614.810.335.9425.120.676.723讨论在早期急性心肌梗死的诊断中血清生化标志物检测有重要价值，目前临床常用的有MYO、CK-MB、cTn【、H-FABP等，早期AMI患者经常表现出非典型的症状，也不出现有诊断意义的心电图表现,胸痛发作6h内血清酶学常在正常范围。H-FABP在AMI发作后3h内浓度上升，因此，H-FABP较cTnI、CK-MB、MB对早期AMI具有更好的诊断价值。研究发现检测血浆H-FABP浓度水平变化，可监测进行性心肌梗死、心脏手术

20、后心肌梗死，评估心肌梗死面积大小网。实验应用杂交瘤技术成功制备2种识别不同抗原位点的抗H-FABP特异单抗，以其中一种单抗(7C8)作为包被抗体，另一单抗(2G4)标记HRP作为信号抗体，制备了检测H-FABP双抗体夹心EUSA试剂盒。为提高检测方法的灵敏度、特异性、稳定性和准确性，在包被及检测抗体的浓度选择等方面进行了大量的试验。为降低非特异性反应的干扰，对封闭液的组成、标记抗体、底物的使用浓度等进行实验分析，从而获得最优实验条件，在保证检测灵敏度的基础上,将非特异性反应降到最低。对试剂盒的的性能进行评估，结果表明，该试剂盒具有较高的灵敏度、特异性、准确性及良好的稳定性。通过对357份健康人

21、血浆中H-FABP含量的检测，健康人血浆中H-FABP的质量浓度正常参考值为1.87-8.50ng/mL,与文献报道的正常参考值略有差别,这可能与参比品定值、试剂盒及人种的差异有关。检测AMI患者血清60份,H-FABP的质量浓度为(25.86.7)ng/mL,明显高于健康人血浆中H-FABP含量。实验是定量检测血中H-FABP浓度，此法具有较高的灵敏度、特异性及准确性，可为临床提供有价值的实验室参数。但是，要应用于临床AMI的诊断,还需扩大检测样本量，确定准确的诊断临界值。参考文献IOkamotoF,SohmiyaK,OhkaniY,etal.Humanheart-typecytoplasm

22、icfattyacid-bindingprotein(H-FABP)forthediagnosisofacutemyocardialinfarction.ClinicalevaluationofH-FABPincomparisonwithmyoglobinandcreatinekinaseisoenzynieMBJ.ClinChemLabMed.2000,38(3):231-238.2AihadiiA,FoxKA.Doweneedadditionalmarkersofmyocytenecrosis:thepotentialvalueofheartfatty-acid-bindingprotei

23、nJ.QJM,2004,97(4):187-198.NakataT,HashimotoA,HaseM.elal.Humanheart-typefatlyacid-bindingproteinasanearlydiagnosticatniprognosticmurkerinacutecoronarysyndrome*J.Cardiology,2003.99(2)：96-104.4ScinoY.TomitaY,TakanoT,cta).Officecardiologistscooperativestudyonwholebloodrapidpaneltestsinpatientswithstispi*cious