单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞DNA的氧化损伤及修复

1、单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞DNA的氧化损伤及修复 【关键词】 单细胞凝胶电泳；DNA单链断裂；DNA氧化损伤；DNA修复摘要：目的 观察小鼠成纤维细胞由过氧化氢(H2O2)引起的DNA损伤及其修复，并详细介绍单细胞凝胶电泳技术。方法 培养NIH3T3细胞，H2O2造成细胞氧化损伤，单细胞凝胶电泳技术(SCGE，Comet Assay)检测细胞DNA的损伤情况。结果 建立了H2O2致NIH3T3细胞DNA损伤的分级图谱；H2O2引起的小鼠成纤维细胞DNA单链断裂与H2O2的浓度呈依赖性关系；细胞在除去H2O2后15min已出现明显修复，多数修复可在1h内完成，但少数修复可能需要较长时间

2、才能完成。结论 单细胞凝胶电泳技术是一种简便、敏感的检测DNA氧化损伤的方法。关键词：单细胞凝胶电泳；DNA单链断裂；DNA氧化损伤；DNA修复Oxidantinduced DNA damage and the reparationin NIH3T3 mouse fibroblasts by single cell gel electrophoresisABSTRACT: Objective To study H2O2induced single strand breaks(SSB) formation in DNA and the reparation in NIH3T3 mouse fib

3、roblasts by single cell gel electrophoresis technique (SCGE, Comet Assay) and to introduce SCGE. Methods The NIH3T3 mouse fibroblasts were incubated, and cell damage was induced by H2O2 and determined by SCGE. Results H2O2induced damage class graph of the DNA Comet in the NIH3T3 mouse fibroblasts wa

4、s established. H2O2induced SSB was H2O2 dosedependent. The reparation of the damaged DNA was timedependent and could be achieved 15min after incubation. The data indicated that most reparations were completed within 1 hour, but a few might take longer time. Conclusion Single cell gel electrophoresis

5、 technique is a simple and sensitive method to determine oxidationinduced single strand breaks(SSB) formation in DNA.KEY WORDS:single cell gel electrophoresis technique(SCGE); single strand breaks(SSB); oxidantinduced DNA damage; DNA reparation许多资料显示染色体的诱变、肿瘤的形成以及衰老都与DNA损伤相关联1。观察药物对DNA氧化损伤及修复的影响，对全面

6、阐述药物抗氧化作用以及探讨药物的作用机理具有重要意义。目前检测DNA损伤的方法主要有：用高效液相色谱法检测细胞、组织或尿液等体液中DNA碱基修饰的代谢产物8羟基鸟嘌呤；用单细胞凝胶电泳技术(SCGE, Comet Assay)检测细胞的DNA损伤34。作者在日本研修期间用单细胞凝胶电泳技术在小鼠成纤维细胞上观察了由H2O2引起的DNA的损伤及其氧化损伤后DNA的修复，现将这种方法及实验结果介绍如下。1 材料与方法1.1 药品试剂 细胞培养介质 DMEM和小牛血清(FBS)购自Sigma公司；细胞培养平皿为Coring公司产品；Comet Assay试剂盒购自Trevigen公司。1.2 细胞培

7、养及H2O2损伤方法 DMEM培养液中加入10%(体积分数)小牛血清(FBS)、青霉素和链霉素各100u/mL。 NIH小鼠成纤维细胞(NIH3T3)用该培养液调整至3.3104个细胞/mL的细胞悬液，将细胞接种于直径35mm的培养皿(3mL/皿)，于37、5%(体积分数)CO2的细胞培养箱中培养24h。置换成不含小牛血清的DMEM，在培养皿中加入H2O2使终浓度分别为0.3-0.5mmol/L，培养15min。再次置换成新鲜的含10%(体积分数)小牛血清的DMEM，分别于H2O2处理后即刻、15、30、60、120min收集细胞进行单细胞凝胶电泳分析。1.3 单细胞凝胶电泳(Comet As

8、say) 本方法的原理是先将细胞固定在葡聚糖凝胶中，用碱(0.3mol/L NaOH)将DNA变性，然后使DNA裂解所形成的片段在电场中迁移，没有受损伤的DNA，因分子较大迁移较慢保留在原来核的位置，而受损伤的DNA则被裂解成较小的片段而发生明显的迁移，DNA被荧光染色后在荧光显微镜下观察，可见裂解的DNA片段形成象彗星一样的长尾，根据“彗尾”的形状、亮度、尾长评价DNA的损伤。收集的细胞与10g/L低熔点葡聚糖凝胶(保温在40，pH 10，PBS溶解)混合。将此细胞悬液铺敷于预先已铺设了一层1g/L葡聚糖凝胶的玻片上，玻片在4放置10min后，被置于溶胞液中2.5mol/L NaCl、100

9、mmol/L EDTA、10mmol/L Tris、1%(体积分数)TritonX100，pH= 104，60min。然后水平地置于裂解液中(0.3mol/L NaOH、1mmol/L EDTA，pH13)4，20-40min，TBE缓冲液洗两次，每次5min。于TBE缓冲液中电泳10min(1V/cm)，乙醇脱水，自然干燥，滴加SYBR Green于凝胶层上，在荧光显微镜下观察细胞形成的DNA彗尾。1.4 DNA彗尾级别的记录 根据DNA损伤后形成的荧光彗尾的形状、头的亮度及尾的长度将其分为5个级别，以表示DNA损伤的程度。根据预先制成的标准图谱(图1)，每个样品记录100个细胞的DNA彗尾

10、的级别填入表1，并计算样品各级分布的百分频率和AU(arbitrary units)。AU的计算：DNA彗尾级别从0-4级分别被规定其AU为0、100、200、300、400，每个样品的AU=各级分布频率各级单位数。 表1 Comet Assay样品DNA彗星的级别百分频率分布表和AU单位（略）Table 1 The frequency percentage of DNA Comet on the class and arbitrary units on the sample举例：样品1 AU=60%0+30%100+10%200=50(AU)样品2 AU=20%100+60%200+10%3

11、00+10%400=210(AU)1Visioli F, Grande S, Bogani P, et al. The role of antioxidants in the Mediterranean diets: focus on cancer J. Eur J Cancer Prev, 2004,13(4):337343.蔡凌霜,曾昭睿,吴采樱. DNA氧化损伤产物及其检测方法 J. 分析测试学报, 2001, 20(5):8893.Mihalis P, Orestes T, Dimitrios G. Glucose oxidaseproduced H2O2 induces Ca2+dependent DNA damage in human peripheral blood lymphocytes J. Free Radical