先天性巨结肠患儿一氧化氮合酶的免疫组织化学观察

1、先天性巨结肠患儿一氧化氮合酶的免疫组织化学观察先天性巨结肠是儿科较常见的疾病，新生儿的发病率为1/20 0001/30 0001。其病理表现主要为结肠远端神经节细胞完全缺乏。现已证实一氧化氮（NO）是人类肠道非肾上腺非胆碱能神经的递质，能有力地松弛平滑肌。我们采用一氧化氮合酶（NOS）免疫组织化学方法间接反应NO的情况，以了解在先天性巨结肠扩张段，移行段，狭窄段NOS的分布状况，探讨NO在先天性巨结肠发病中的意义。 一、材料与方法1标本的收集与处理：收集1998年内先天性巨结肠新鲜标本10份，患者年龄10 d3岁，其中新生儿5例。每例分别取扩张段，移行段，狭窄段3个部位全层肠壁。先天性巨结肠的

2、诊断均依据病史，体征，钡灌肠综合判断确诊，术后均经常规病理检查证实。2免疫组织化学染色技术：所有标本均做6 m厚冷冻连续切片，免疫组织化学采用SP法染色，NOS多克隆抗体选用Santa Cruz公司产品，神经元特异性烯醇化酶（NSE）、S-100蛋白单克隆抗体选用Zymed公司产品，显示系统选用Histostain-SP试剂盒，DAB显色。所有染色均用已知阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。所有标本同时行常规石蜡切片，HE染色。3免疫组织化学结果判断：以肠壁粘膜下及肌间神经丛内NOS、S-100、NSE 阳性着色的神经节细胞、神经纤维的有无，增生或减少作为观察指标。二、结果1大体观察：

3、结肠的一部分显著扩张、肥厚，直径可达56 cm。而狭窄部分直径仅为1 cm，肠壁无明显增厚。移行段直径界于扩张段和狭窄段之间。2HE染色：扩张段粘膜下层及肌间神经丛内均可见清晰的神经节细胞，部分神经节细胞内可见到尼氏小体。移行段：粘膜下层和肌间神经节细胞少，且明显变性，胞膜不清，胞质浓染，尼氏小体消失，细胞核固缩。狭窄段：各层均未见神经节细胞，粘膜下及肌间神经纤维较扩张段显著增粗。3免疫组织化学染色：NOS阳性的神经节细胞和神经纤维分布于扩张段和移行段的肌间神经丛及粘膜下神经丛内。以扩张段最多。扩张段：在肌间神经丛及粘膜下神经丛内出现NOS及NSE强阳性的神经节细胞（1）。且二者的分布基本一致

4、。S-100蛋白对此神经节细胞无免疫反应。在肌间神经丛、环行肌、纵行肌内及粘膜下可见NSE、S-100、NOS阳性神经纤维。这些纤维呈黄褐色，以S-100蛋白更清晰。三者均在环形肌分布最多,粘膜下层最少。S-100及NSE阳性纤维在各层均多于NOS阳性纤维，前两者分布相似。移行段：肌间神经丛及粘膜下神经丛内有NOS和NSE阳性的神经节细胞，但明显少于扩张段。粘膜下及肌层内NOS阳性的神经纤维亦少于扩张段。而S-100和NSE阳性的神经纤维与扩张段比较无明显减少。狭窄段：各层均缺乏NOS和NSE阳性的神经节细胞。粘膜下及肌间仅见少量NOS弱阳性的神经纤维，大部分神经纤维呈NOS阴性反应。但NSE

5、，S-100蛋白仍成强阳性表达， 且神经丛较扩张段明显增粗。1扩张段肌间神经丛神经节细胞NOS表达SP法400三、讨论1990年Bult等2证实刺激胃肠道的非肾上腺非胆碱能神经可引起NO的释放。由于NO半衰期很短，常规方法不易测到，但可通过对NOS的检测间接反应NO的情况。本实验通过NSE、S-100染色来显示肠道神经节细胞及神经纤维的分布，将其作定位与NOS染色对照观察。其结果，NOS和NSE阳性的神经节细胞分布基本一致。在扩张段，阳性着色的神经节细胞明显多于移行段。在狭窄段，未见NOS和NSE阳性的神经节细胞。 NOS阳性的神经纤维在扩张段明显多于移行段，而在狭窄段仅见少量弱阳性表达的神经

6、纤维。NSE、S-100阳性的神经纤维在狭窄段非但没有减少，而且有增生。许多学者已证实增生的神经纤维是引起肠道平滑肌收缩的胆碱能神经。这样，在狭窄段就造成了引起肠道平滑肌松弛的非肾上腺非胆碱能神经和引起平滑肌收缩的胆碱能神经的失衡，导致该段肠管持续性痉挛，进而发生巨结肠。 本实验结果与Larsson等3的实验结果一致。Okelly等4用还原性辅酶依赖性黄递酶NADPH-d观察先天性巨结肠病人肠道NOS的分布，其结果亦与本实验所用免疫组织化学结果一致。Hanani等5在对3例先天性巨结肠病人NOS的定量分析中发现，在狭窄段，3例病人的平均NOS活性明显低于扩张段。扩张段的含量与非先天性巨结肠病人

7、十分相似。作者单位：胡晓丽（天津市儿童医院病理科 300074）王学文（天津市儿童医院病理科 300074）詹江华（天津市儿童医院外科 300074）参考文献1，刘彤华.食管、胃、肠和肛门.见:刘彤华,主编.诊断病理学.北京：人民卫生出版社,1995.96.2，Bult H，Boeckxstaens GE，Pelckmans PA, et al. Nitric oxide as an inhibitory non-adrenergic non-cholinergic neurotransmitter. Nature，1990，345：346-347.3，Larsson LT，Shen Z，Ek

8、blad E，et al. Lack of neuronal nitric oxide synthase in nerve fibers of aganglionic intestine：a clue to Hirschsprungs disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr，1995，20：49-53. 4，OKelly TJ, Davies JR,Tam PK, et al. Abnormalities of nitric- oxide- producing neurons in Hirschsprungs disease：morphology and implications. J Pediatr Surg，1994，29：294-299.5，Hanani M，Louzon V, Udass