兔病毒性出血症疫苗研究进展.docx

1、动物医学进展，2013,34(3):95-100ProgressinVeterinaryMedicine兔病毒性出血症疫苗研究进展郑艳利，王开，马红霞，高云航.（吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130118）摘要：目前对兔病毒性出血症（RHD）的控制主要以预防为主，使用的疫苗可分为灭活病毒疫苗、组织灭活疫苗、复合佐剂疫苗、重组蛋白疫苗、活病毒载体疫苗、核酸疫苗。相对传统灭活病毒疫苗，近年来针对RHD的重组蛋白疫苗发展更快、取得的成就更大，为详细分析RHD疫苗的发展取得成就及各种疫苗的不足，论文对RHD疫苗的发展进行了综述，希望为RHD疫苗的开发提供有用的参考资料。关键词：兔病毒性出血症；兔出

2、血症病毒3疫苗中图分类号：S852.659.6文献标识码：A文章编号：1007-5038(2013)03-0095-06兔病毒性出血症(Rabbitviralhemorrhagicdisease,RHD）俗称兔瘟，是由兔出血症病毒（Rabbithemorrhagicdiseasevirus*RHDV）引起的一种急性高致死性传染病。该病在临床上以全身实质器官收稿日期：2012-09-07基金项目：吉林省科技发展计划项目（20100230）作者简介：郑艳利（1987），女，河南安阳人，硕士，主妾从亨预防兽医学研究。*通讯作者H.*.n*#n*n*x*n*M*i*«H4K<x*im*

3、K*mH>*E*m*ProgressonBalantidiumcoliWANGTian-qil,SONGHong-xiao2,YANWen-chao1,QIANWei-feng*,YUANLin1,JIANGYing1(1.CollegeofAnimalScience&-TechnologytHenanUniversityofScienceTechnology.Luoyang,Henan,4710Q3,Chinai2.LuoyangAnimalDiseaseControlCenter,Luoyang,Henan,470Q2,China)Abstract:Balantidiumco

4、liisacosmopolitanparasitic-opportunisticpathogenthatinfectshumanandothermammalianhostsincludingpigs,andisthelargestprotozooninfectinghumanandnonhumanprimates.Pigsareitsmajornaturalreservoirhosts,andhumanbecomesinfectedthroughdirectorindirectcontactwithpigs.Thecontaminateddrinkingwatersourcewithfeces

5、fromtheinfectedpigsmaycauseemergingpublichealthevents.B.coliislocatedinthecolonandcecumofhumanandotheranimals,occasionallytransfertoextra-intestinalorgansincludinglungs,urino-reproductiongutsandpelviccavity,andthediseasedhostsmayremainasymptomatic,ormayoccurbloodyandmucus-containingdiarrhea.Effectiv

6、esanitationanduncontaminatedwaterarethemostusefulweaponsagainstinfection.Here,taxonomicstatus,morphologicalcharacteristics,genotyping,culturecharacteristics,resistance,pathogenesismechanism,epidemiology,diagnosis,preventionandcontrolofB.coliwerereviewed.KeywordsBalantidiumcoli,trophozoite?cysthore(P

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10、，而2月龄以下幼龄兔或尤其吮乳兔多具有抵抗力，极少发病或不发病。RHDV属于嵌杯病毒科兔嵌杯病毒属，为单股正链RNA病毒，基因组由7437个核昔酸组成，有2个开放阅读框架（ORF）3】。前者编码一种多聚蛋白，这种蛋白最终裂解为非结构蛋白部件（解旋酶、蛋白酶、RNA依赖的RNA聚合酶）和主要的结构蛋白（衣壳蛋白VP6O）。后者编码VP10蛋白，它作为一种基质蛋白少量地存在于病毒粒子中衣壳蛋白VP60是诱导宿主保护性免疫反应的主要抗原，在病毒诊断和疫苗设计方面发挥着重要的作用。目前报道RHD只有一个血清型，RHDV各分离株VP60基因高度保守，核昔酸及氨基酸同源性均在90%以上。RHDV的主要表位

11、抗原基因VP60在原核和真核细胞中均得到了成功的表达，并且表达产物接种家兔后取得了良好的免疫效果。活病毒载体疫苗有可自主复制和水平传播的特点，适合对野兔进行接种。核酸疫苗是利用基因重组得到含有VP60基因序列核酸片段载体，技术尚未成熟，还处于研发阶段。1兔病毒性出血症灭活苗1.1组织灭活疫苗组织灭活疫苗主要取自感染兔肝脏，经甲醛灭活制得，具有良好的免疫效果，在免疫接种30d60d后血凝抑制（HI）抗体上升至较高水平，可达到71og2左右。常规灭活疫苗在免疫接种4h后可以检测出干扰素，效价为9000U/mL，同时可以检测出IL-12”。6d8d产生保护性抗体，16d18dHI抗体达到11log2

12、以上，以后缓慢下降。1.2复合佐剂蛆织灭活疫苗复合佐剂疫苗应用于兔瘟预防比较普遍,常用的佐剂主要有油乳剂、氢氧化铝佐剂、氟氏佐剂等，加入佐剂后免疫效果显著提高。如庄国宏等采用皮下注射方法免疫接种RHDV油乳剂疫苗，兔子免疫接种50d后产生抗体极显著高于组织灭活疫苗接种兔的抗体水平，免疫保护率高。张小飞等将兔瘟氢氧化铝佐剂疫苗与常规组织灭活苗进行对比试验发现，免疫接种氢氧化铝佐剂苗兔免疫接种60d90d后HI抗体效价达到101og2以上，疫苗保存时间由8个月增长到12个月，便于生产中使用。近几年来，出现了一些新的佐剂用于兔瘟灭活疫苗，主要有蜂胶、黄茂多糖、人参皂昔、植物花粉多糖及CpG保守序列等

13、，并且取得了良好的免疫效果。如WeiK等'E用台山市马尾松花粉多糖、黄芷多糖和组织灭活疫苗结合对獭兔进行免疫接种.发现马尾松花粉多糖、黄氏多糖作为佐剂免疫效果均提升显著，添加不同剂量佐剂具有不同程度的免疫增强效果，并且同剂量情况下，马尾松花粉多糖免疫增强效果优于黄芷多糖，每只兔子用400mg花粉多糖佐剂量最佳。宁康健等研究蜂胶对兔瘟组织灭活苗免疫效果的影响，发现免疫兔抗体水平第10天效价为41og2,第20天抗体水平已达8.25log2,30d抗体水平高达H.001og2,明显高于组织灭活苗免疫接种效果。YangLS等成用中药佐剂黄茂多糖、人参皂昔和疫苗结合对幼兔免疫接种，发现中药佐剂

14、促进了兔的淋巴细胞增殖,抗体水平高于保护水平（31og2）o试验表明疫苗和中药佐剂显著性地增强了兔对兔出血症病毒的免疫接种反应。叶背华°将制作完备的组织灭活苗、油佐剂疫苗、蜂胶佐剂疫苗、铝胶佐剂疫苗、细菌CpGDNA佐剂疫苗、转移因子疫苗、复合佐剂疫苗1、复合佐剂疫苗2免疫接种家兔,均取得了一定的免疫效果，以油佐剂疫苗、蜂胶佐剂、细菌CpGDNA佐剂、复合佐剂疫苗1、复合佐剂疫苗2的效果较好，尤以复合佐剂疫苗1、复合佐剂疫苗2最好。复合佐剂疫苗1产生抗体时间最早，可作为紧急治疗用,复合佐剂疫苗2的免疫持续期最长，可作为预防用。2VP60重组蛋白疫苗由于RHDV在体外被感染细胞中不易存

15、活.因此不宜采用细胞培养方法获得大童VP60病毒衣壳蛋白，现行疫苗多采用自然或人工感染RHDV致死的兔肝脾组织制备组织灭活疫苗，抗原制备麻烦，纯化过程繁琐，且抗原特质难免会发生一些变化。因此.探索用应用现代生物技术研制新型疫苗是解决这一问题的重要途径，由于VP60在诱导宿主免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原,且编码基因高度保守，可用于制备RHD重组蛋白疫苗，近年来国内外学者已经成功的在不同的表达系统中表达了RHDVVP60重组蛋白。2.1杆菌载体表达的重组蛋白疫苗构建RHDV保护性抗原VP60基因表达载体.导入大肠埃希菌和干酪乳杆菌中，可以获得VP60蛋白前体，再经后续处理，可获得RH

16、D®组蛋白疫苗。张大鹏等扩增兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因，将其克隆到pET28a（+）载体匕，构建重组表达载体pET28a（+）VP60,并在大肠埃希菌（BL21）中以包涵体形式高效表达，重组蛋白分子质鼐为60ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫原性，为VP60转基因研究奠定了基础。SuH等眼采用RT-PCR方法扩增VP60抗原表位基因，然后连接到pET-28b(28)载体上，导入E.coli中进行表达，通过Westernblot检测到所表达的重组蛋白，分子大小约24.0kuo通过ELISA方法检测纯化的VP60重组蛋白抗原特性，证明其具有良好的免疫原性。GromadzkaB等对

17、VP60抗原基因进行测序，反转录构建cDNA,PCR扩增后连接到pGEM-T和pFastBac,构建pFastBacl-vp60-l和PFastBacl-vp60-2表达载体，最后通过基因特异位点重组导入大肠埃希菌，分别表达全序列和缩减端点的VP60重组蛋白。用获得的重组蛋白免疫接种家兔，可以使其抵抗RHDV超强毒株的攻击。隋慧等川】采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b(+)为表达载体，在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Westernblot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性，验证了VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好

18、的免疫原性。张祎'用干酪乳杆菌(Laclobacillusasei393)作为递呈抗原活菌载体，以VP60保护性抗原基因主要中和位点为靶基因，定向插入到干酪乳杆菌表面表达和分泌型表达载体pPG-l与pPG-2,构建了pPG-l-VP60/L.easei393和pPG-2-VP60/L.easei393重组乳酸杆菌系统。结果表明，约80ku融合蛋白得到表达。分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后，对诱导表达的菌体及培养上清液进行SDS-PAGE检测表明，有约70ku蛋白得到了表达，Westenblot结果分析这两种载体所表达的蛋白具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性。以此活菌作为口服制剂，进行兔

19、体免疫接种试验，发现重组干酪乳杆菌表达系统既可刺激机体产生体液免疫应答，又可诱导局部黏膜免疫应答，为兔病毒性出血症重组乳酸菌口服疫苗的研制奠定了基础。2.2酵母载体表达的重组蛋白疫苗酵母作为真核细胞表达的VP60重组蛋白具有表达量大、易于分离纯化、免疫原性强、稳定等优点，受到过国内外研究者的关注。Farnds。等"研究发现，所有用酵母衍生的RHDV抗原免疫接种家兔均产生了强烈RHDV特异性免疫反应，并且在初次免疫接种后免疫保护能够持续一年时间，优于灭活病毒诱导的免疫反应。因此，多聚体VP60蛋白是研制预防兔瘟的低价规模化的优选重组蛋白疫苗。FarnosO等凶将Span-ishisol

20、ateAST/89的VP60在酵母中进行了高效表达，VP60蛋白表达量高达1.5&/L,通过密度测定扫描分析发现大约70%的表达蛋白进行了糖基化修饰，通过从天然病毒粒子提取VP60蛋白制备的多克隆抗体的免疫学分析发现该表达蛋白抗原性与天然VP60一致，将该表达蛋白与弗氏佐剂混合免疫接种兔后能够产生病毒特异抗体，能够抵抗100LD50RHDV的攻击。严维巍等将RHDVVP60基因插入pPICZB,经毕赤酵母表达的重组蛋白具有血摄性，该血凝性可被RHDV的高免血清抑制，表明该VLPs与天然RHDV具有相似的抗原性。2.3植物载体表达的重组蛋白疫苗构建转基因植物表达载体获得VP60重组蛋白，

21、进行口服免疫接种，对预防兔RHDV感染有重要意义。Fernandez-FernandezMR等昼采用洋李痘马铃薯Y病毒(Plumpoxpotyvirus)构建的载体成功表达了RHDV的VP60,将植物中表达的VP60抽提出来对兔进行免疫接种，结果表明该表达产物接种兔能抵御致死剂量RHDV的攻击。CastanonS等*将RHDVAST/89株VP60在马铃薯中进行表达，结果表明转基因马铃薯表达的蛋白与天然VP60相似，分子质量约为60ku,用1mL转基因叶片提取物(含12产固重组VP60)加氟氏完全佐剂皮下分点免疫接种成年家兔，产生了特异的抗体反应，并宜能够提供对RHDV强毒攻击的保护。GilF

22、等可比较VP60重组蛋白在转基因植物组织中的表达和稳定性，表明植物细胞中存在多亚基结构蛋白是非常重要的，它可以和VP60结合形成复杂、高密度、稳定的重组蛋白结构，可以进行口服免疫接种，并推测可能会成为RHD免疫接种的一种新方法。MikschofskyH等构在mRNA和蛋白质水平上分析了VP60在4种不同转基因植物(烟草、马铃薯、油菜、豌豆)中的表达状况，结果表明烟草和豌豆中表达量相近，占到可溶性总蛋白的0.01%左右，但只有豌豆可以通过自授粉遗传VP60抗原基因，并证明豌豆中产生的重组蛋白免疫接种兔子,使其能够抵抗RHDV的攻击。但利用植物组织表达VP60重组蛋白也有阴性结果报道。Miksch

23、ofskyH等mi研究烟草表达CTB：VP60融合蛋白，经过反复优化发现此蛋白表达量还晕很低。推测可能是由于重组蛋白VP60分子过大导致，切除VP60两个不同的N末端融合于CTB,表达量未得到显著提高。2.4杆状病毒昆虫细胞系统表达的直组蛋白疫苗利用杆状病毒-昆虫细胞系统表达VP60重组蛋白疫苗，具有表达最大、体外基因重组阳性率高、效率高、免疫原性强等特点，受到国内外研究者的青睐。刘怀然等利用Bac-to-Bac杆状表达系统在昆虫细胞-杆状病毒中表达病毒样颗粒（VLPs）,经免疫荧光和Westernblot检测发现表达蛋白可与RHDV多克隆抗血清发生特异性免疫反应。表达蛋白分子质最约为68ku

24、,将含VLPs的细胞裂解液加弗氏佐剂免疫接种兔，证明VLPs具有免疫原性，为重组蛋白疫苗的研制奠定了基础，同时在转移载体及RHDV受体方面研究也有潜在价值。PerezFilgueiraDM等徵利用一种表达重组RHDV衣壳蛋白VP60的杯状病毒感染粉纹夜蛾幼体。与发酵相比，在昆虫幼体细胞产生蛋白生产的RHDV疫苗潜在成本将大大减少。王芳等"刃将VP60蛋白在sf9昆虫细胞中表达得到重组病毒rAcV-Bac-VP60重组。在不添加任何佐剂情况下，用表达蛋白免疫接种3月龄非RHD免疫兔。在免疫接种后21d,兔体内可产生抗RHDV抗体,抗体血凝抑制效价在沙2,之间，该抗体可以抵抗血凝效价为2

25、"的致死剂量RHDV强毒攻击，为兔病毒性出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。3重组病毒载体疫苗3.1站液瘤病毒载体疫苗用黏液瘤病毒Myxomavirus,MV）减毒株和RHDV基因重组获得的疫苗不仅可以使家兔抵抗RHDV和黏液瘤的攻击，而且具有在动物个体间扩散的能力，促进动物间的接触性免疫传播,适合野生兔群免疫接种。如于倩°们体外培养RK13细胞后，将MVTK基因与重组病毒TK基因区域进行同源重组.筛选出重组病毒MV-VP60,该重组病毒可表达RHDV的结构蛋白VP60,能够诱导产生高水平的RHDV和MV特异性抗体。通过皮下注射重组病毒MV-RHDV,经跳蚤等吸血昆虫携带重

26、组病毒，使其在野兔群中进行传播，能够使野兔群免受兔黏液瘤病及兔病毒性出血症的侵袭。郭臻以兔黏液瘤病毒为重组病毒载体，以黏液瘤病毒的非必须基因MST3N基因为同源重组位点，制备能同时抵抗兔出血症病毒和黏液瘤病毒两种病毒的重组疫苗。皮下注射重组病毒疫苗后，家兔血清内产生了RHDV抗体，并且能抵御最强毒力的黏液瘤病毒毒株的攻击。SpibeyN等研究用黏液瘤病毒作为重组病毒载体，成功研制了预防黏液瘤和兔病毒性出血症的双功能疫苗，并且皮下注射接种4周后，用RHDV和黏液瘤病毒致病萌株攻毒免疫接种过的兔子存活率达到了100%。3.2腺病毒载体疫苗腺病毒可以感染很多分裂期或静止期细胞.即使在一些高度分化的组

27、织细胞中也可增殖，如可有效的感染肌肉组织、心、肺和脑组织，并能高效的复制、表达其基因产物，因此腺病毒可作为活病毒载体疫苗研究的重要对象。王兴龙等构建了表达RHDV衣壳蛋白的腺病毒重组载体并通过蛋白质印迹分析试验得到了验证。对18只家兔直接口服免疫接种或者用饵料免疫接种均产生了抗RHDV特异性抗体和细胞免疫反应。胡波等3心】将VP60基因克隆至pShuttle-CMV重组腺病毒并在HEK293细胞中得到表达，接种免疫接种2月龄以上非RHD免疫接种兔，结果表明，在免疫接种22d后可以诱导兔体产生抗RHDV抗体.可抵抗血凝价为以上的致死剂鼠RHDV强毒的攻击。FernandezE等K将抗原基因克隆至

28、pAdtrack-CMV质粒中产生重组腺病毒pAdtrackVP60,导入HEK293A细胞中得到表达。接种免疫接种8周龄母兔，免疫效果和采用灭活RHDV组织疫苗或者酵母、昆虫产生的重组蛋白疫苗免疫接种的效果相似。3.3羊口疮病毒载体疫苗羊口疮病毒（ORFV）感染动物后.机体能产生很强的免疫反应，通过CD14、Toll样受体和病毒的特异成份信号作用，刺激早期致炎细胞因子和相关的Thl细胞因子的释放，激活单核细胞和抗原递呈细胞，产生的IL-12和IL-18细胞因子乂能引起由T细胞和自然杀伤细胞引发的病毒调节的y干扰素的释放，因此羊口疮病毒有望作为新的疫苗载体°RohdeJ等3眨利用羊口

29、疮病毒构建了一种新的病毒表达载体（D1701-V-VP1）,ELISA检测被免疫接种兔血清表明此重组载体不仅可诱导兔产生抗RHDV的特异抗体，还检测到IL-2,而在非D170PV-VP1免疫接种的兔子血清中是检测不到的。攻毒试验表明被接种IO'pfu剂量的D1701-V-VP1重组载体的兔子可获得抵抗致死剂量的RHDV感染的免疫力。3.4痘病毒载体疫苗在DNA病毒中，痘病毒可在被感染细胞的胞浆内增殖的现象是独有的，其DNA分子具有感染性，将裸露的基因转染进细胞后能够进行复制。痘病毒借助细胞酶不能转录病毒基因组,不能产生病毒蛋白，因此痘病毒具有作为活病毒疫苗载体的先天优势。Bertagn

30、oliS等用重组痘苗病毒表达了VP60蛋白，结果表明该重组蛋白分子质量为60ku,可与抗RHDV的抗体发生反应，用重组病毒通过皮内和口服途径接种兔，可产生高水平的抗RHDV抗体，能使免疫接种兔耐受RHDV的强毒攻击。4重组基因核酸疫苗核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。随着疫苗研究的开展，对病毒衣壳蛋白VP60核酸疫苗进行可行性研究对于完善RHDV基因工程疫苗的研究是必要的。张夏兰何将中国白兔IL-6基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建真核表达质粒pcDNA-IL

31、-6。将构建的真核表达质粒pcDNA-IL-6用脂质体包裹，制备成分子佐剂，通过脂质体转染法转染真核传代细胞Vero细胞，培养48h后，用免疫荧光试验观察，真核表达质粒pcDNA-VP60在Vero细胞中成功地表达出了具有免疫原性的VP60蛋白，为进一步研究免出血症病毒VP60DNA疫苗提供了科学依据。5结语目前接种疫苗仍是控制兔病毒性出血症的主要手段，新研制的重组蛋白疫苗、活病毒载体疫苗等疫苗具有产量大，性质稳定、易于保存、免疫原性强、适合批量化生产等优点，更具有较好的应用前景。在提高免疫效果的同时，还应注意简化疫苗接种工作量，提高对动物的安全性及改善动物福利等方面的问题，以便使疫苗有更广阔

32、的应用空间。与其他类型的重组蛋白疫苗相比，核酸疫苗采用病毒的部分核酸序列，不存在散毒或返强的危险，不存在病毒活苗的安全性问题，蛋白表达在动物体内进行，不存在一般原核表达系统中蛋白翻译后不能糖基化的问题，因此更具有开发潜力，但如何有效提高核酸疫苗在宿主细胞内的表达水平是需要克服的关键技术，有待于继续深入研究。今后疫苗的研究将以如何克服新型兔瘟疫苗各自不足之处，并有效地预测和预防基因改造所带来的潜在危害，将实验室研究和产业化生产结合起来，充分发挥各种新型兔瘟疫苗的优势。参考文献：1付瑞贺争鸣.兔出血症桐毒分子生物学研究进展JJ.实验动物科学与管理，2003.20(1),30-32.2杨龙圣，薛家宾

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