06课件一激光共聚焦扫描显微功能

1、-基本原理及实例应用基本原理及实例应用2013-4-132013-4-1320122012级课程进修班细胞生物学技术级课程进修班细胞生物学技术它和荧光显微镜的关系？它和荧光显微镜的关系？它和电子显微镜的关系？它和电子显微镜的关系？观察的信号如何而来？观察的信号如何而来？第一部分第一部分-以激光作为激发光源，采用光源针孔与检以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。泛指将微小泛指将微小( (分辨率分辨率0.2M)0.2M)不可见或难见物不可见或

2、难见物品之影像放大品之影像放大 , ,而能被观察的工具。而能被观察的工具。目镜目镜光源光源聚焦旋钮聚焦旋钮光阑和聚光器光阑和聚光器载物台载物台物镜物镜用于研究荧光或荧光标记物质的光学显微镜。用于研究荧光或荧光标记物质的光学显微镜。照相装置照相装置分光镜分光镜光源（汞灯）光源（汞灯）标记了荧光的样品标记了荧光的样品紫外、蓝、绿紫外、蓝、绿高压汞灯高压汞灯被荧光探针染被荧光探针染色的生物样本色的生物样本激发激发被标记结构的被标记结构的荧光光学图像荧光光学图像光学成像光学成像滤镜分光滤镜分光物镜物镜标本标本针孔（针孔（pinholepinhole）焦平面焦平面荧光显微镜荧光显微镜光源针孔检测针孔激光

3、共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜分光镜分光镜光源光源检测器检测器标本标本物镜物镜荧光显微镜系统荧光显微镜系统样品样品激光共聚焦扫描系统激光共聚焦扫描系统断层扫描技术，断层扫描技术，逐点逐行扫描成像逐点逐行扫描成像CCD成像技术，成像技术，一次性成像一次性成像X X光机光机CTCT机机普通荧光显微镜激光共聚焦显微镜特点：特点：侧面有扫描器接口；侧面有扫描器接口；装有微量步进马达；装有微量步进马达；装有防振动装置；装有防振动装置；装有光路转换装置；装有光路转换装置；配高数值孔径的物镜。配高数值孔径的物镜。特点：特点：侧面有扫描器接口；侧面有扫描器接口；装有微量步进马达；装有微量步进马达；装有防

4、振动装置；装有防振动装置；装有光路转换装置；装有光路转换装置；配高数值孔径的物镜。配高数值孔径的物镜。荧光显微镜光源 汞灯汞灯 卤素灯卤素灯 其他普通光源其他普通光源特点激发波长范围广激发波长范围广 激光共聚焦显微镜光源 激光激光特点光色纯光色纯方向性好方向性好能量可调能量可调-以激光作为激发光源，采用光源针孔与检以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。优势优势高垂直分辨率，使光学切片，高垂直分辨率，使光学切片，三维重建成为可能三维重建成为

5、可能高水平分辨率高水平分辨率 人眼分辨率：人眼分辨率：0.20 mm 光学显微镜分辨率：光学显微镜分辨率：0.25 mm 共焦显微镜分辨率：共焦显微镜分辨率：0.18 mm 电子显微镜分辨率：电子显微镜分辨率： 0.20 nm局限局限共聚焦显微镜的分辨率理论极限大共聚焦显微镜的分辨率理论极限大约是约是0.15 mm，轴向分辨率，轴向分辨率0.5 mm。观测厚度（观测厚度（60X）：）：50-100 mm共聚焦显微镜是逐点成像，成共聚焦显微镜是逐点成像，成像速度较慢像速度较慢1957年，年，Marvin Minsky在他的专利中首次阐明了激光扫在他的专利中首次阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的基本

6、工作原理描共聚焦显微镜技术的基本工作原理1967年，年，Egger和和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面一个光学横断面1970年，年， Sheppard 和和Wilson推出第一台单光束共聚焦激推出第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世光扫描显微镜问世1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像，至此除焦点模糊，得到清晰的图像，至此LSCM技术基本成熟技术基本成熟1987年，年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜微镜扫描

7、器系统荧光显微镜系统计算机图像存储与处理系统Zeiss LSM-710 Confocal System激光光源第二部分第二部分光学切片光学切片高清晰成像高清晰成像荧光定量分析荧光定量分析三维图像重建三维图像重建多激光多通道同时扫描多激光多通道同时扫描激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰。平面的光线被抑制，减少了成像的干扰。使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的达普通光学显微镜的1.41.4倍。倍。可以清晰的表现一些细微结构。可以清晰的表现一些细微结构。鼠成纤维细胞 微管涡虫

8、纲扁虫肌动蛋白丝检测人类癌细胞表皮生长因子小鼠神经元细胞 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。可以逐层获得高分辨率的光样品扫描层面的厚度。可以逐层获得高分辨率的光学横断面图像，从而对细胞和组织进行无损伤的系学横断面图像，从而对细胞和组织进行无损伤的系列光学切片。列光学切片。连续分层扫描，可获得标本真正意义上的三维数据。连续分层扫描，可获得标本真正意义上的三维数据。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。三维重组。胚胎的结构单层面扫描单层面扫描 多层叠加多层叠加切片分

9、层叠加激光扫描共聚焦显微镜通过逐层光学切片功能，可获激光扫描共聚焦显微镜通过逐层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经过计算机图像处理得标本真正意义上的三维数据，经过计算机图像处理软件及三维重建软件获得标本的三维立体结构，从而软件及三维重建软件获得标本的三维立体结构，从而能灵活、直观地进行形态学观察，并揭示细胞结构的能灵活、直观地进行形态学观察，并揭示细胞结构的空间关系，测量细胞结构间的空间距离空间关系，测量细胞结构间的空间距离普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。种荧光标记的样品需要多次观

10、测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。通道同时探测。牛精子绿色：SYBR 14染色，活精子红色：PI染色，死精子绿色：MitoTracker Green 紫色：Hoechst 33342 藤黄微球菌绿色：活菌红色：死菌染色：LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit 细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的表达差异。不同培养时间条件下的表达差异。荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标荧光探针的特异性标记：

11、即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。记蛋白的表达量成正相关。随机选择细胞或区域，测定其荧光强度值，并进随机选择细胞或区域，测定其荧光强度值，并进行统计分析。行统计分析。利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。同组间荧光标记蛋白表达的差异。随机圈取细胞，可得到所圈细胞的相对荧光强度值利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同

12、培养时间条件下的水平差异。培养时间条件下的水平差异。第三部分第三部分荧光：物质吸收能量后所释放出的冷发光现象荧光：物质吸收能量后所释放出的冷发光现象 通常为吸收短波长的能量后发散出长波长的光通常为吸收短波长的能量后发散出长波长的光荧光光谱：荧光光谱：激发光谱激发光谱通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发波长变化而获得通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发波长变化而获得的光谱。的光谱。发射光谱发射光谱荧光物质的荧光发射强度随放射波长变化而获得的光谱。荧光物质的荧光发射强度随放射波长变化而获得的光谱。488nm 525nmFITC450nm 490nm自发荧光：指组织细胞不经任何荧光染色便自发荧光：指

13、组织细胞不经任何荧光染色便能够激发荧光。能够激发荧光。免疫荧光：荧光抗体法产生荧光。免疫荧光：荧光抗体法产生荧光。外源导入荧光蛋白：利用转基因技术将荧光外源导入荧光蛋白：利用转基因技术将荧光蛋白基因导入细胞里，蛋白基因导入细胞里，让其表达融合蛋白而产让其表达融合蛋白而产生的荧光。生的荧光。组组织织和和细细胞胞中中荧荧光光的的来来源源荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发出特征波长的能够在光的作用发出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态荧光，借以观察组织细胞的形态结构、化学组成和功能。结构、化学组成和功能。由于长波能量低由于长波能量低, ,

14、细胞忍受能力强细胞忍受能力强, , 适合活体检测。适合活体检测。荧光极其稳定荧光极其稳定, ,在激发光照射下在激发光照射下,GFP,GFP抗光漂白能力比荧抗光漂白能力比荧光素强，适合长时间观察。光素强，适合长时间观察。分子量较小分子量较小, ,易与目的基因形成融合蛋白且不影响自身易与目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。的目的基因产物的空间构象和功能。238238个氨基酸组成。个氨基酸组成。吸收峰吸收峰 479 nm 479 nm发射波长发射波长 508 nm 508 nmu19621962年，日本下村修（年，日本下村修（ShimomureShimomure）等首先从

15、）等首先从维多利亚水母中分离出了维多利亚水母中分离出了GFP GFP 。u20082008年，美国科学家钱永健、马丁年，美国科学家钱永健、马丁沙尔菲和沙尔菲和下村修三人因发现下村修三人因发现GFPGFP而获得诺贝尔化学奖。而获得诺贝尔化学奖。衍生物和突变体：衍生物和突变体：BFPBFP、CFPCFP、GFPGFP、YFPYFP荧光探针与荧光标记：采用一定的标记物，使样品中待测物荧光探针与荧光标记：采用一定的标记物，使样品中待测物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这种质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这种给样品赋予特征荧光的操作称作荧光标记。给样品赋予特征荧光的操作称

16、作荧光标记。荧光探针的种类：荧光探针的种类：大分子探针大分子探针细胞器探针细胞器探针核酸探针核酸探针金属离子探针金属离子探针细胞电位和细胞内细胞电位和细胞内pHpH值探针值探针分子的特殊集团结合探针分子的特殊集团结合探针选择的依据：选择的依据：根据实验目的确定需要检定的指标；根据实验目的确定需要检定的指标；确定可供选择的荧光探针的范围；确定可供选择的荧光探针的范围；考察荧光探针的特性是否符合荧光样考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求；品的制备要求；考察荧光探针与所用共聚焦显微镜系考察荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。统的匹配情况。标记的荧光需要在不被其他因素的干扰下能标记的荧光

17、需要在不被其他因素的干扰下能被激光共聚焦显微镜系统检测到被激光共聚焦显微镜系统检测到原则：尽量减小不同荧光物质间激发原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。发射光谱的重叠。标记要求标记要求荧光素选择荧光素选择/组合组合核复染核复染单标单标 无特殊限制。无特殊限制。 FITC, Cy2最佳；尽量不选择最佳；尽量不选择Cy5, Cy5.5（红外（红外) 与自发荧光冲突时，采用与自发荧光冲突时，采用Texas Red 。PI / DAPI双标双标FITC/Cy2+TEXAS REDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3 (必须顺序扫描必须顺序扫描)DAPI (必须必须顺序扫描顺序扫描

18、)三标三标FITC/Cy2 + TEXAS RED + Cy5.5FITC/Cy2 + RHODAMINE/Cy3 + Cy5.5 (必须顺序必须顺序扫描扫描)活细胞追踪活细胞追踪 能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间 存在、随细胞分裂进入子细胞存在、随细胞分裂进入子细胞 ( ) 显微注射；转基因技术显微注射；转基因技术 （GFP；GFP-ACTIN）1. 1. 作为亚细胞定位的标记作为亚细胞定位的标记蛋白定位在哪里呢蛋白定位在哪里呢 ？2. 2.作为整体结构的标记作为整体结构的标记图中共有多少个细胞？图中共有多少个细胞？

19、阳性蛋白的表达效率是多少？阳性蛋白的表达效率是多少？原则：尽量减小不同荧光物质间激发原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。发射光谱的重叠。标记要求标记要求荧光素选择荧光素选择/组合组合核复染核复染单标单标 无特殊限制。无特殊限制。 FITC, Cy2最佳；尽量不选择最佳；尽量不选择Cy5, Cy5.5（红外（红外) 与自发荧光冲突时，采用与自发荧光冲突时，采用Texas Red 。PI / DAPI双标双标FITC/Cy2+TEXAS REDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3 (必须顺序扫描必须顺序扫描)DAPI (必须必须顺序扫描顺序扫描)三标三标FITC/Cy2 +

20、TEXAS RED + Cy5.5FITC/Cy2 + RHODAMINE/Cy3 + Cy5.5 (必须顺序必须顺序扫描扫描)活细胞追踪活细胞追踪 能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间 存在、随细胞分裂进入子细胞存在、随细胞分裂进入子细胞 ( ) 显微注射；转基因技术显微注射；转基因技术 （GFP；GFP-ACTIN）样品前处理样品前处理组织切片：切片的厚度组织切片：切片的厚度 4-50 mm 4-50 mm 冰冻切片：优点是易操作，荧光背景低；缺点是容易破坏组织结构，不利于形态观察。冰冻切片：优点是易操作，荧光背景低；

21、缺点是容易破坏组织结构，不利于形态观察。 石蜡切片：优点是样品易保存，缺点是容易引入干扰荧光。石蜡切片：优点是样品易保存，缺点是容易引入干扰荧光。细胞标本：细胞标本： 细胞种类和纯度杂细胞的干扰会导致错误实验结果。细胞种类和纯度杂细胞的干扰会导致错误实验结果。 细胞密度：如果进行形态观察、三维重建、定位荧光信号，细胞密度不低于细胞密度：如果进行形态观察、三维重建、定位荧光信号，细胞密度不低于2020； 如果是测定荧光强度，细胞约占视野面积的如果是测定荧光强度，细胞约占视野面积的8080。 承载细胞的器皿：承载细胞的器皿： petri petri皿（又称小皿）：适用面最广，可用于活的或固定的细胞样品。皿（又称小皿）：适用面最广，可用于活的或固定的细胞样品。 盖玻片：适用于固定的细胞。盖玻片：适用于固定的细胞。 样品前处理样品前处理-荧光标记荧光标记-上机观察上机观察 样品前处理样品前处理-荧光标记荧光标记-上机观察上机观察荧光标记荧光标记染料直接染色：生物样品与荧光探针直接作用，使样染料直接染色：生物样品与荧光探针直接作用，使样品具有荧光。品具有荧光。免疫荧光：是将抗体标记上荧光素与细胞或组织内相免疫荧光：是将抗体标记上荧光素与细胞或组织内相应的抗原结合后，通过观