Western blot

1、Western blot一、Western blot历史及原理蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，简称WB。1975年，继Edwin Southern发明的“Southern Blot”，1977年George Stark及其同事发明的“Northern Blot”技术之后，受以上两个“转印”技术的启示，1981年“Western Blot”这一技术正式问世。抗体技术的发展，电泳及转膜技术的改进使得Western Blot操作日益简单；分析方法及工具多样化、成像技术的革新、高灵敏度示标信号的出现使得Western Blot的检测范围得到扩

2、展，定量/半定量成为可能。目前Western Blot设备不断更新、技术不断发展，WB仍将在较长时间和应用领域内得到更加广泛的应用，其检测灵敏度也将不断提高。其基本原理与ELISA相似：通过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离混合蛋白质样品，转印到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以转印到固相载体上的蛋白质（多肽）作为抗原，与对应的抗体（又称一抗）特异性结合，特异性抗体再与酶、荧光素或同位素标记的抗一抗抗体（又称二抗）起反应，经过底物显色或放射自显影以检测样品中特异性蛋白（见图1）。一抗的质量是WB成功的关键，现在市面上抗体公司很多，一般选择大公司大品牌

3、的抗体对于实验的成功很有保证。但是由于实验经费的限制只能选择小公司或国产二线品牌的抗体，这个时候需要使用者尽可能多考究：完整的质检数据；售后承诺；技术人员对产品的熟悉程度。对于二抗来说，选择就更需谨慎，虽然二抗看似简单，其质量却千差万别，对实验结果的影响也尤为重要。福因德科技（Frdbio）专注于免疫检测产品的开发和工艺研究，只做精品；如果客户购买的产品质量达不到标明的水平，无条件退货。对于WB的底物是根据二抗的标记酶来确定的，有大家较为熟悉的辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡

4、萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、半乳糖苷酶-Galactosidase，不同的酶对应的底物当然也不同，并且底物被催化后应该是不扩散不溶解的图1.Western blot 原理示意图Western blot的主要流程如下：样品制备 总蛋白质的定量 SDS-PAGE电泳 转膜 封闭 一抗孵育 二抗孵育 加底物，显色/显影，定影/化学发光，下面将对这些步骤详细介绍。二、Western blot操作流程在熟悉原理之后实验人员可以根据操作流程轻松开展实验，下面主要介绍关于Western blot的主要操作流程。 样品制备： 动物细胞总蛋白的提取：细胞都含有一个保护细胞不受外界环境干扰的细胞

5、质膜，细胞质膜主要由磷-脂双分子层组成。两性的脂质形成的等离子体膜在具有亲水基团的同时也含有疏水性基团，从而自发的形成一个封闭的双分子层壁。膜蛋白嵌入在脂质双分子层,横跨疏水区，也就是说细胞膜主要由脂质和蛋白质组成，但其各成分的比例则是随细胞类型及生物种属的不同而对应变化。实验中提取细胞蛋白用到的裂解液中含有的表面活性剂如Triton-100、NP-40、SDS等，能够插入并破坏细胞膜的磷脂双分子层，从而达到细胞裂解的目的。这一类裂解液商品化的有很多，比如福因德科技研制的Western及IP细胞裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105）、RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.W

6、BR0103）、NP-40裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0104）等。在蛋白提取过程中尽量冰上操作以防止蛋白降解，也可适量加入蛋白酶抑制剂PMSF，福因德科技(Frdbio)可提供效果较好的蛋白酶抑制剂（Frdbio,Cat No.WBR0114）。对于加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除收集贴壁细胞外还应收集培养液中的细胞。 细菌及植物组织总蛋白的提取：对于动物细胞来说质膜是其唯一的保护屏障，但是在植物细胞和细菌的质膜外还有一层坚硬的细胞壁存在。细菌的细胞壁主要由肽聚糖组成，由n-乙酰葡萄糖胺和n-乙酰胞酸两种氨基糖经-1.4糖苷键连接间隔

7、排列形成的多糖支架。而溶菌酶可以水解这一糖苷键从而达到裂解细胞的目的。对于细菌的裂解可以用含有一定浓度溶菌酶的PBS缓冲液（TE,pH8.0）即可。而植物细胞壁主要由纤维素和果胶组成的，这为植物细胞赋予了细胞形状和刚度。对于植物组织蛋白的提取目前多用机械破坏法如液氮研磨或化学法如三氯醋酸-丙酮沉淀法或TCA丙酮沉淀法； 对于需要提取特殊亚细胞结构的蛋白如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白、细胞膜蛋白等，由于操作比较麻烦，可以选用商业化的试剂盒，例如福因德科技(Frdbio)研制的核蛋白提取试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0106）与线粒体蛋白提取试剂盒（Frdbio,Cat No.W

8、BR0109）、细胞浆蛋白提取试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0108）。 总蛋白质的定量：提取样品的总蛋白后需要对提取的蛋白作定量分析，以便于电泳时上样量的把握。目前蛋白定量主要有Lowry法、BCA法（Frdbio,Cat No.WBR0202）、沉淀法、Bradford法（Frdbio,Cat No.WBR0204）等，任何定量都需要选一个标准蛋白作为定量依据，绘制标准曲线，常用的且方便可靠的就是BSA（牛血清蛋白）。 制作标准曲线一般选用BSA来制作标准曲线，作为定量标准用的BSA（Frdbio,Cat No.WBR0205），其纯度和理化性质必须相当的标准。配制一定浓度的B

9、SA标准溶液，按需求进行梯度稀释，然后根据各种定量方法测定器数值，绘制标准曲线。福因德科技（Frdbio）有作为定量专用的BSA溶液提供（Frdbio, CatNo.WBE0205），商业化的蛋白定量测定试剂盒中都有标准BSA配置。 蛋白含量的测定蛋白含量测定的方法有多种，例如Lowry法、BCA法、沉淀法、Bradford法，但目前相对于另外两个来说BCA法和Bradford法使用较多。在裂解细胞时使用的裂解液若是Western及IP细胞裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105）、RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0103）、NP-40裂解液（Frdbio,Cat

10、No.WBR0104）等，则可选用福因德科技（Frdbio）的BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（Frdbio,Cat No.WBR0202）、BCA蛋白定量试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0201）或Bradford蛋白浓度测定试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0204）搭配使用，但不同的试剂盒测定精确度不同，可根据实验需要进行选择，客户可根据实际需要登陆我们网站查询相关产品说明书。SDS-PAGE电泳 制样上样总体积一般不超过15l，上样前将样品与上样缓冲液按要求混合后沸水中煮5 min使蛋白变性后立即冰浴。一般使用的是5×上样缓冲液和2×上样缓冲液，

11、5×上样缓冲液的配置方法是：250mM Tris-HCl(pH6.8)、10%(W/V)SDS、0.5%(W/V)、0.5%(W/V)溴酚蓝、50%(V/V)甘油、5%(W/V)-巯基乙醇。2×上样缓冲液的则在5×的基础上各含量减半。为节约科研工作者的时间和精力，可选择福因德科技（Frdbio）的商品化上样缓冲液，可选择5×的蛋白上样缓冲液（Frdbio,Cat No.WBR0304A）和2×的上样缓冲液（Frdbio,Cat No.WBR0304B）。 制胶聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(

12、简称Bis)在催化剂过硫酸铵(APS)，N，N，N，N- 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，具有分子筛效应。它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）,没有加变性剂如SDS，电泳过程中蛋白质保持完整的天然状态，蛋白在其中依三种因素进行分离：蛋白大小，结构和电荷；另外一种是变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）,在样品和凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白的二、三级结构被破坏，加入的SDS与蛋白结合后使得蛋白带有很强的负电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，最终蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小和凝胶分子孔

13、径排阻效应。对于待检蛋白活性有较高要求的实验中，一般选用Native-PAGE，因为非变性胶在分离蛋白后对蛋白的活性并没有明显的影响，例如EMSA。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时，要用低pH凝胶系统，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。分离酸性蛋白时候，要利用高pH（8.8）凝胶系统，蛋白会带负电荷向阳极移动，SDS -PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，由浓缩胶（上层胶）和分离胶（下层胶）组成，当电泳开始后，电泳开始时缓冲液中的氯离子泳动最快,甘氨酸根离子最慢，因此在中间形成低电导区，使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一个狭窄的区带。在进入

14、分离胶后蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的大小移动，从而达到分离蛋白的目的。蛋白分子量不同，所适用生物SDS-PAGE浓度也会对应不同，下表是聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）和对应的蛋白质分离范围（kD）聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）有效分离范围（kD）65015083090102080121260151040配制的凝胶质量对电泳条带的清晰度以及背景有着密切的影响，灌胶前玻璃板一定要洗干净并且用吸水纸擦干；灌胶时不能有气泡；凝胶要彻底才能点样电泳。另外制胶的药品丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在溶解后有毒，因此在制胶过程中一定要小心，注意安全。现在为方便科研工

15、作者，已经有商业化的SDS-PAGE凝胶试剂盒，例如福因德科技（Frdbio）的SDS-PAGE凝胶试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0401）。 电泳当样品处在浓缩胶中时电压不宜过高，可将电压调在80V，在电泳大概30min左右，蛋白进入分离胶中，此时可稍微调高电压至120V。电泳过程中由于系统会产热，为得到较好的结果电压不宜过高，但是为节约时间也不能太低，以上是经过实验总结出的较好的电压选择。为方便观察电泳效果和转膜效果以及判断蛋白分子量大小，最好使用彩色预染蛋白分子量标准（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。蛋白迁移不仅与蛋白自身性质以及PAGE凝胶有关，与电泳液也有

16、一定的关系。电泳液的离子强度，pH等都会影响蛋白的迁移。电泳液可以选择使用福因德科技（Frdbio）生产的SDS-PAGE电泳液（Frdbio,Cat No.WBR0301）。 转膜将凝胶分离的蛋白从凝胶转移到膜上，目前方法有很多，比如溶移印相法、毛细管转移法、热对流转移法、真空印迹转移法、电转移法等，电转移法由于其快速性及高效性一直备受科研工作者的青睐。转膜的原理与电泳相同，蛋白与SDS结合形成复合体带负电，在正负电场作用下，蛋白从凝胶中转印到膜上。由于膜对蛋白的吸附作用很强，同时由于甲醇的固定作用，所以转移到膜上的蛋白也不会轻易穿透膜“跑出去”，但是对于小分子量的蛋白质还是很容易透过膜的孔

17、径“穿透”出去。所以对于小分子量的蛋白质的转印，转印时间不宜太长。转膜仪的红色代表正极，黑色代表负极，组装时先把湿润的海绵和滤纸依次铺在负极上，再铺上凝胶，随后是膜，接着是滤纸和海绵，形成“三明治”结构（见图2）。注意在铺凝胶和膜的时候一定要注意不能有气泡，尽量用玻璃棒除掉所有气泡。图2.湿转转膜“三明治”结构半干转的原理与湿转是一样的，是将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷。在电转仪上铺3层湿润的滤纸，再将膜铺在先铺滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些转移缓冲液到膜上；小心的将凝胶覆在

18、胶上，并做上记号；再在凝胶上铺3层滤纸，注意的是此过程中要保证所有的夹层都是湿润的，半干转膜的夹层示意图如下（图2）。图2. 半干转膜的夹层示意图电转移法转膜有可分为湿转和半干转：湿转是一种比较传统的方法，一般使用4预冷的转膜缓冲液，并且在4条件下进行。湿转电流一般选择在200400mA，时间为3090min，也可以1520mA转膜过夜。片段>50kD的可以选用350mA，小片段的可以用250mA，具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定。半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽，因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法比较快。但是，半干转移

19、法中滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路；另外半干转过程中会大量产热但是不好降温，容易将膜烘干；且半干转的效果不如湿转的好，因此还是推荐大家使用湿转的方式。转膜的效率不仅跟蛋白在特定条件下与膜的结合能力也有关，另外还取决于凝胶的成分、凝胶与膜的接触是否彻底、转膜的时间，蛋白大小、蛋白组成以及电泳液。WB实验中常用的膜有PVDF和NC膜，PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固；PVDF膜使用是需要甲醇预处理的，用目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。而NC膜的使用也很简便，不需要预处理，只

20、要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了。不过NC膜比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途；而PVDF膜具有较高的机械强度，是印迹法中的理想固相支持物材料。转膜结束后可以用丽春红染液（Frdbio,Cat No.BHP0370）或者氨基黑10B或印度墨水检测转膜效果，丽春红染色液对膜进行染色不会干扰后续对膜的处理；也可以考染转膜后的PAGE凝胶，检查蛋白是否有残留。 封闭从凝胶上转印的蛋白不能把膜表面全部占据，因此需要封闭膜上剩余的位点防止抗体非特异性吸附，这就是封闭。最常用的封闭物质是一些非相关蛋白，常见的有BSA、脱脂奶粉、各种动物血清、酪

21、蛋白；封闭缓冲液的对后续蛋白检测的灵敏度、背景、信号强弱都有很大的影响。不同的抗原/抗体会适应不同的封闭缓冲液，所以对于检测效果不怎么理想的蛋白需要开展预实验对其封闭缓冲液配方进行优化。福因德科技（Frdbio）所用封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST(24.22g Tris、87.66g NaCl,加盐酸调pH8.0，0.05%的Tween-20)。 洗涤同其他免疫检测技术一样，WB每一步的试剂孵育之后都要有一步洗涤，洗去游离的未结合的试剂、抗体，洗涤不充分会造成背景高，产生噪音信号，洗涤过度又会导致灵敏度降低，因此对于洗涤液的配方及洗涤时间的控制都需要优化。通常用的洗涤液是含有Tris的TBS

22、或含有磷酸盐的PBS缓冲液，为降低非特异性结合，一般会在洗涤液中加入终浓度0.05%的Tween-20。需要注意的是WB中使用的有些试剂如NP-40、Tween-20容易滋生微生物及真菌，而这些污染会对结果产生很大的影响，因此在实验过程中所用到的试剂都要新鲜配制，过滤除菌，4存放，一定要保证所用到的试剂都是无菌高纯度的。福因德科技使用的洗涤液是TBST(0.05% Tween-20)。 一抗孵育WB主要是由一抗特异性识别膜上的目的蛋白或抗原决定簇，一抗的选择主要依据于待检抗原，需要注意的是并不是所有的一抗都适合于Western检测的使用。一抗的稀释度通常需要预实验摸索条件，可以根据说明书上建议

23、的WB稀释度附近做23个梯度，如果是用化学发光法检测，由于其灵敏度高因此建议将稀释度再降低25倍，甚至10倍。 二抗孵育二抗的选择主要有三个原则：效价高；高效价的二抗对WB的结果很重要；效价高的二抗在使用时由于稀释倍数高，自然非特异性吸附就低得多，背景也就低了。二抗效价高不但是二抗效价高，同时HRP标记的效率也要高。背景低，抗体的纯度一定要高，高纯度的抗体产生的非特异性背景较少。；质量稳定，质量稳定是比较难以把握但是又必须保证的，这就需要在制备抗体抗体过程中所有操作都是可重复的，每一步都有严格的质控，同时在稳定剂和配方工艺上优化，福因德科技（Frdbio）就是按此要求来工作的，研发出的抗体都是

24、高质量且稳定的抗体。在Western检测过程中一抗对于靶蛋白的识别并不是通过直接的方法进行检测的，一般标记的二抗才是检测的直接对象。二抗的作用是放大信号，它是根据一抗而决定的，比如一抗来源于未免疫的小鼠，那么二抗必须是来源于小鼠之外的抗鼠IgG。另外，二抗的标记也要根据检测方法选择合适的标记，也就是二抗的标记与显色方法是配套使用的。目前商品化的二抗种类很多，标记种类也有多样供大家选用。比如HRP（辣根过氧化物酶）标记、AP（碱性磷酸酶）标记、Biotin（生物素）标记、等标记的二抗，其中福因德科技（Frdbio）已经研究出70余种标记二抗。对于抗体的稀释度从1:1001：500,000不等，母

25、液浓度一般为1mg/ml。不同的检测系统对抗体的稀释也会有不同的需求，当然检测灵敏度越高则抗体稀释度越高，反之亦反。但是抗体的浓度最好不要太高，争取有限的抗体可以得出漂亮的检测结果，因为低浓度的抗体因为增强了亲和的特异性而有利于降低背景。 底物显色目前在WB检测中最常用的酶是AP和HRP，鉴于HRP的物美价廉，高性能的卓越表现，使AP渐渐退出历史舞台。AP对应的底物为BCIP/NBT，您可以选择商品化的BCIP/NBT试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0601）。HRP对应的底物很多，DAB、TMB、ECL等。与其他酶相比AP有一个独特的优势是在高灵敏度时可较长时间显色，但长时间显色必

26、然带来背景高的后果。以上所说的是通过酶化底物产物不溶性沉淀物来显示信号并记录信号的，被称为WB第一代信号呈现技术；为了提高其灵敏度，科研工作者将鲁米诺（ECL）作为HRP的底物，催化其发光，通过底片曝光、显影、定影记录信号，称为WB第二代信号呈现技术，第二代信号呈现技术仍然是手工操作，需要暗房冲洗底片，人为控制影响因素很多，随着仪器技术的发展，出现了WB第三代信号呈现技术：第三代信号呈现技术的底物和第二代相同，只不过其是通过仪器记录信号的，其仪器核心元件为冷光CCD。第三代技术通过电子技术可以很容易控制曝光时间，得到效果较好的图片，但是仪器成本太高，最便宜的价格都在10万元以上。现如今第一代信

27、号呈现技术已经基本被淘汰，第二、三代呈现技术核心是鲁米诺（ECL）化学发光底物，Pierce公司的Super-Signal系列化学发光液稳定性好但是价格昂贵，福因德科技（Frdbio）在化学底物领域已掌握核心技术，其生产的ECL化学发光底物（Frdbio,Cat No.WBR0107）品质与Pierce系列产品媲美。三、Western blot1.蛋白样品提取（1）细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液。2、每瓶细胞加3 ml ，4 预冷的Western及IP细胞裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105）或RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.

28、WBR0103）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将裂解液弃净，把培养瓶置于冰上。3、按1 ml裂解液加10l PMSF (100 mM)（Frdbio,Cat No.WBR0114），摇匀置于冰上。4、每瓶细胞加400l含PMSF裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行)6、于4 下12000 rpm离心5 min。7、将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于-20 保存

29、。（2）组织中总蛋白的提取：1、将少量组织块用干净的剪刀尽量剪碎，并置于12 ml匀浆器球状部位。2、加400l裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。3、重复碾几次使组织尽量碾碎。4、裂解30min后，可用移液器将裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105、Cat No.WBR0103）移至1.5 ml离心管中，然后在4 下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于-20 保存。（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按(一)操作外还应收集培养液中的细胞。培养液中细胞总蛋白的提取： 1

30、、将培养液倒至15ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。2、弃上清，加入4 mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。3、用枪吸干上清后，加100l裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105、Cat No.WBR0103）(含PMSF)冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4 、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20 保存。2.蛋白含量的测定用BCA蛋白定量试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0201）测定蛋白含量，如下

31、表：试剂管号12345空白管测定管蛋白质标准液L (1 mg/mL)2040608010000ddH2O (L)8060402001000待测样品 (L)000000100BCA工作液 (mL)2222222混匀，37 保温30 min，用562 nm比色，测定吸光值测定结果3.SDSPAGE电泳 清洗玻璃板： 制样点样量一般为10l，根据样品的浓度选择合适的上样缓冲液：若蛋白浓度较高，选择2×的上样缓冲液（Frdbio,Cat No.WBR0304B），将蛋白与上样缓冲液按11的体积比混匀后，100煮样5min；若蛋白浓度不是特别高则可选用5×的蛋白上样缓冲液（Frdbi

32、o,Cat No.WBR0304A），将蛋白与上样缓冲液按41的体积比混匀后，100煮样5min即可。煮样结束后立即取出冰浴，等待点样。 制胶注意：一定要带手套，因为其中的丙烯酰胺为神经性致毒剂，对神经系统有损伤作用；加入各成分后一定要混匀，否则可能会有局部凝固的现象；操作一定要快，防止提前凝固；下表是配制浓缩胶和对应浓度的分离胶各成分的含量分离胶：（10ml） 不同浓度凝胶各成分体积 （ml）各组分名称6%8%10%12%15%H2O5.34.64.03.32.330% Acrylamide2.02.73.34.05.01.0M Tris-HCl（pH8.8）2.52.52.52.52.51

33、0% SDS0.10.10.10.10.110%AP(过硫酸铵)0.10.10.10.10.1TENED0.0080.0060.0040.0040.004总体积1010101010浓缩胶：（5ml）各组分名称体积(ml)H2O3.430% Acrylamide0.831.0M Tris-HCl（pH6.8）0.6310% SDS0.0510%AP(过硫酸铵)0.05TENED0.005为了方便客户，减少客户在配制丙烯酰胺凝胶过程中对人体伤害，福因德科技（Frdbio）推出了凝胶配制试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0401），为了更方便科研工作者，福因德科技（Frdbio）还推出了预制

34、胶供客户选用。 上样注意：点样前需离心，取上清点样；所有孔都点样，所点样品体积和量都差不多，重要样品点中间一点，最两边不要点重要样品；为了便于标识分子量，WB建议使用彩色预染Marker（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。 电泳80 V电压进行电泳，待溴酚蓝至浓缩胶和分离胶分界处时，改电压为120V继续电泳，溴酚蓝至胶底部1 cm左右时停止电泳，耗时大约90min。4.转膜（以湿转为例）（1）根据胶的尺寸准备相同大小的滤纸6张和PVDF或NC膜1张(一定要戴手套)。PVDF膜使用前需要用甲醇活化，NC膜使用时转膜液中需要加20 %甲醇（转膜液/甲醇体积比41）。（2）将夹子打开使

35、黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫三层滤纸，赶去其中的气泡。（3）分离胶盖于滤纸上与滤纸对齐，赶去气泡。将膜盖于胶上，在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一张海绵垫，合起夹子。（5）将夹子放入转移槽中，夹的黑面对槽的黑面（电源负极），白面对槽的红面（电源正极）。根据目的蛋白分子量确定转膜时间和电流。湿转一般推荐设定电流为300400mA,转膜时间为4060min。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定。目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。一般分子量在60kD以下的250m,60min即可，分子量在60kD以上的需要增大电流值300

36、mA，延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。另外，转膜过程中产热比较厉害，最好是放在冰浴中进行。（6）转膜后用丽春红染液（Frdbio,Cat No.BHP0370）染膜或直接考马斯亮蓝染PAGE胶，检测转膜效率。5.抗体孵育（1）标记转印面后将膜移至含有封闭液（5%的脱脂奶粉溶解在TBST缓冲液中）的容器中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。（2）封闭完之后，用TBST洗涤12次，将一抗中用TBST按照说明书推荐比例进行稀释，制备成一抗工作液，一般在12002000；将膜放入一抗工作液中，室温下孵育12 h或4孵育过夜，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次8 min；再用TBS

37、洗一次，8 min。（3）同上方法孵育二抗工作液，二抗一般稀释1100010000福因德科技（Frdbio）二抗稀释度都在13000以上；用TBS-T在室温下脱色摇床上洗两次，每次8 min；再用TBS洗一次，8 min。6.化学发光，显影，定影（1）将ECL发光试剂盒的A液（配方：1.722g鲁米诺用0.1mol/L的NaOH溶解后用水定容至1L）和B液（0.1mol/L的Na2S2O8溶液）两种试剂等体积混合，配成ECL化学发光工作液；将膜的转印面与此混合液充分接触；15 min后，吸尽残液，覆膜，放入胶片夹中。（2）在暗室中，将显影液和定影液分别倒入显影定影缸中；在红灯下取出胶片，剪裁适

38、当大小；把胶片放在膜上，关上胶片夹；根据信号的强弱适当调整曝光时间；曝光完成后，取出胶片，浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影结束后，马上把胶片浸入定影液中，定影时间以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。（显影液配方：750ml温水（3045）、3.5g米吐尔、45g无水亚硫酸钠、12g几奴尼、45g无水碳酸钙、2g溴化钾，加冷水定容至1L；定影液配方：600ml 50的水、240g硫代硫酸钠、15g无水亚硫酸钠、48ml 28%的醋酸、7.5g硼酸、15g明矾加水定容至1L）福因德科技（Frdbio）有高品质的显/定影液可供客户选用（Frdbio,Cat

39、No.WBR0801）。7.凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值等。 上样注意：点样前需离心，取上清点样；所有孔都点样，所点样品体积和量都差不多，重要样品点中间一点，最两边不要点重要样品；为了便于标识分子量，WB建议使用彩色预染Marker（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。 电泳80 V电压进行电泳，待溴酚蓝至浓缩胶和分离胶分界处时，改电压为120V继续电泳，溴酚蓝至胶底部1 cm左右时停止电泳，耗时大约90min。4.转膜（以湿转为例）（1）根据胶的尺寸准备相同大小的滤纸6张和PVDF或NC膜1张(一定要戴手套)。PVDF膜使用前

40、需要用甲醇活化，NC膜使用时转膜液中需要加20 %甲醇（转膜液/甲醇体积比41）。（2）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫三层滤纸，赶去其中的气泡。（3）分离胶盖于滤纸上与滤纸对齐，赶去气泡。将膜盖于胶上，在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一张海绵垫，合起夹子。（5）将夹子放入转移槽中，夹的黑面对槽的黑面（电源负极），白面对槽的红面（电源正极）。根据目的蛋白分子量确定转膜时间和电流。湿转一般推荐设定电流为300400mA,转膜时间为4060min。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定。目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间

41、越短。一般分子量在60kD以下的250m,60min即可，分子量在60kD以上的需要增大电流值300mA，延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。另外，转膜过程中产热比较厉害，最好是放在冰浴中进行。（6）转膜后用丽春红染液（Frdbio,Cat No.BHP0370）染膜或直接考马斯亮蓝染PAGE胶，检测转膜效率。5.抗体孵育（1）标记转印面后将膜移至含有封闭液（5%的脱脂奶粉溶解在TBST缓冲液中）的容器中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。（2）封闭完之后，用TBST洗涤12次，将一抗中用TBST按照说明书推荐比例进行稀释，制备成一抗工作液，一般在12002000；将膜放入一抗工作

42、液中，室温下孵育12 h或4孵育过夜，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次8 min；再用TBS洗一次，8 min。（3）同上方法孵育二抗工作液，二抗一般稀释1100010000福因德科技（Frdbio）二抗稀释度都在13000以上；用TBS-T在室温下脱色摇床上洗两次，每次8 min；再用TBS洗一次，8 min。6.化学发光，显影，定影（1）将ECL发光试剂盒的A液（配方：1.722g鲁米诺用0.1mol/L的NaOH溶解后用水定容至1L）和B液（0.1mol/L的Na2S2O8溶液）两种试剂等体积混合，配成ECL化学发光工作液；将膜的转印面与此混合液充分接触；15 min后，吸尽残液，覆膜，放入胶片夹中。（2）在暗室中，将显影液和定影液分别倒入显影定影缸中；在红灯下取出胶片，剪