酶工程-动植物细胞培养产酶

1、酶工程-动植物细胞培养产酶l概述动物细胞l无细胞壁，容易贴壁l对营养要求严格（血清培养基）l对环境敏感（pH、溶氧、温度、剪切应力）植物细胞l有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱l营养要求较动物细胞简单l生长缓慢，培养周期长，要达到高密度较困难l概述植物细胞、动物细胞、微生物细胞培养的比较l概述植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较l动物细胞、植物细胞和微生物细胞可以用相同方式培养l动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长l植物细胞和动物细胞对剪切力敏感l植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同 动物细胞 蛋白疫苗、抗体、激素、酶（蛋白质或多肽） 植物细胞 色素、香精、天然药物（小分子）、酶l

2、本章主要内容动植物细胞中酶生物合成的调节植物细胞培养产酶l植物细胞及其培养特点l植物细胞培养及产酶的工艺控制动物细胞培养产酶l动物细胞及其培养特点l动物细胞培养及产酶的工艺控制l动植物细胞中酶生物合成的调节从基因到蛋白质有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植物细胞动植物细胞具有比微生物更多的调节方式l转录水平调节l翻译水平调节DNA RNA Protein Active Enzyme转转录录逆逆转转录录复复制制翻翻译译？折折叠叠l动植物细胞中酶生物合成的调节细胞分化改变酶的生物合成 端粒（telomere）l端粒是真核生物染色体的末端结构l由富含 G、T 的 DNA 简单重复序列不断

3、重复而成 人端粒序列：TTAGGGl保护真核生物染色体免遭破坏 牺牲自我，填补 DNA 复制后在 5-端留下的空隙 端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短l端粒酶（telomerase） 催化端粒合成和延长 核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重复序列 端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中l动植物细胞中酶生物合成的调节基因扩增加速酶的合成l通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶段或细胞分化某一过程l细胞的一种应急方式l基因扩增可以由 引起 耐药性细胞的抗药性产生 例：CHO 细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增l动植物细胞中酶生

4、物合成的调节增强子促进酶的生物合成l增强子（modulator） 能高效增强或促进基因转录的一段DNA 序列l增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些酶基因的表达l具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同l动植物细胞中酶生物合成的调节抗原诱导抗体酶的生物合成l抗体酶（abzyme）：催化性抗体，是具有生物催化功能的抗体分子，是人工改造的对抗体可变区赋予催化特性的特殊抗体l修饰法 在抗体与抗原结合部位引进催化基团l诱导法（主要方法） 半抗原诱导 酶蛋白诱导l植物细胞培养产酶1902 年，Haberlandt 首次提出分离植物单细胞并培养成植株的设想植物细胞的全能性l植

5、物细胞培养产酶植物细胞培养产酶种类l植物细胞培养产酶植物细胞结构l植物细胞培养产酶植物细胞的主要特点l体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大l细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，l营养要求较动物细胞简单l细胞生长及合成次级代谢产物需要条件l主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）l植物细胞培养产酶植物细胞培养的优势l提高目标物的产率l缩短生产周期 木瓜蛋白酶：木瓜生长期 8 个月，木瓜细胞培养约 1 个月l易于管理，不受自然因素控制l可以提高产物质量 通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染缺点l培养条件要求高 光照、剪切力影响显著l植物细胞生长缓慢 相对于微生物l植物细胞培养

6、产酶植物体外培养l胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养l植物细胞培养产酶植物细胞培养 外植体选择和处理l外植体（explant） 从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小块 根、茎、叶、芽、花、果实、种子等l选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则l切片：1 cml消毒 70% 乙醇 5% 次氯酸钠 / 10% 漂白粉 0.1% HgCl2l植物细胞培养产酶植物细胞培养 获取植物细胞：直接分离法l直接分离法即直接从外植体中分离l机械法 将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞 质壁未分离；，完整细胞数量少l酶解法 利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞 能降解细胞壁

7、，必须对细胞给予l植物细胞培养产酶植物细胞培养 获取植物细胞：愈伤组织诱导法 由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的的群体 本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的组织l诱导过程 配制半固体诱导培养基 灭菌、植入外植体 13周后继代培养l植物细胞培养产酶植物细胞培养 获取植物细胞：原生质体再生法l一般采用酶解法分离原生质体，使用和混合物l保持溶液的 状态 防止原生质体胀裂 渗透压稳定剂：糖、盐、甘露醇、山梨醇等l原生质体培养，再生细胞壁l植物细胞培养产酶植物细胞培养 悬浮培养l将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法l悬浮培养的细胞

8、一般来源于愈伤组织，选择较松散的为宜植物细胞培养 产物分离纯化l收集培养液，从中获得所需的产物l植物细胞培养产酶植物细胞培养基l水：一般用去离子水或蒸馏水l无机成分 大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Col有机成分 碳源：糖，以 最常用 氮源：氨基酸（Gly、Ala、Ser、Cys）及蛋白水解物、无机氮 维生素：主要是 B 族维生素和维生素 C 其他：肌醇、琼脂等l植物细胞培养产酶常用的植物细胞培养基lMS 培养基 硝酸盐浓度较高，营养成分适宜，使用范围广lB5 培养基 NH4+ 浓度较低，适用于双子叶木本植物lWhite 培养基 无机盐浓度低，

9、高Mg(II)、B(III)，适用于生根培养lKM-8P 培养基 有机成分种类齐全，用于原生质体培养培养基配制l配制母液，使用时按需要稀释l植物细胞培养产酶工艺条件及其控制（掌握要点，与微生物对比）l温度 室温范围（25 oC左右） 最适产酶温度和最适生长温度不同lpH 微酸性（pH 56） 细胞培养时，pH一般变化不大l溶解氧 植物细胞，供氧不宜过量 对剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧烈l植物细胞培养产酶工艺条件及其控制 光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响（植物特色） 光照有时也抑制产物合成l添加前体 前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质 添加前体相对于添加了反应的底物l刺激剂（ele

10、ctor） 引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代谢产物的生物合成 常用微生物细胞壁碎片和胞外酶l植物细胞培养产酶产酶实例 大蒜细胞培养产 SODl超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，） 生物体内清除超氧化物阴离子自由基（O2-）的重要金属酶类 SOD 和过氧化氢酶 (catalase)、过氧化物酶 (peroxidase，POD) 一起构成了生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维护生物体内细胞正常的生理代谢和生化反应l植物细胞培养产酶产酶实例 大蒜细胞培养产 SODl大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮 先用 70% 乙醇消毒 20

11、 s，再用 0.1% 升汞消毒 10 min，然后无菌水漂洗 3 次 在无菌条件下，切成 0.5 cm3 的小块，植入含有 3 mg/L 2,4-D 和 1.2 mg/L 6-BA 的半固体 MS 培养基中 25 oC，600 lux，12 h/d 光照条件下培养 18 天，诱导得到愈伤组织，每 18 天继代一次l植物细胞培养产酶产酶实例 大蒜细胞培养产 SODl大蒜细胞悬浮培养 将上述在半固体 MS 培养基上培养 18 天的愈伤组织，在无菌条件下转入含有 3 mg/L 2,4-D 和 1.2 mg/L 6-BA 的液体 MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25 oC，600 lux，12 h/

12、d 光照条件下振荡培养 1012 天，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞 无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有 3 mg/L 2,4-D 和 1.2 mg/L 6-BA 的液体 MS 培养基中，25 oC，600 lux，12 h/d 光照条件下，振荡培养 18 天lSOD 分离纯化 收集细胞，破碎，用 pH 7.8 磷酸盐缓冲液提取l动物细胞培养产酶1907年，Harrison 开创了动物组织培养的先河l从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，放在青蛙的凝固的淋巴液中培养，蝌蚪的神经组织存活了数周，并且从神经细胞中长出了神经纤维1950s，Earle 用动物细胞培养制取病毒疫苗1967年，动

13、物细胞贴壁培养微载体开发1975年，杂交瘤技术动物细胞可产生较高价值的物质l激素、疫苗、单克隆抗体、酶l动物细胞培养产酶动物细胞结构l动物细胞培养产酶动物细胞特性，细胞脆弱（区别于植物和微生物），比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞l在肌体内相互，以群体形式存在l在培养时具有群体效应、接触抑制性、功能全能性l营养要求复杂（培养基）血清l动物细胞培养产酶动物细胞培养的特点l主要用于生产蛋白质l生长缓慢l容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素（胞外缺少保护结构）l大部分具有贴壁依赖性 l培养基成分复杂，价格高昂l细胞生命有限，一般最多继代培养 50 代即退化死亡l动物细胞培养产酶动物

14、细胞培养方式 悬浮培养l适用于非贴壁依赖型细胞、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴液）细胞l类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较大差别 对通气、搅拌耐受性差 对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一定比例 l优点（相对于贴壁培养） 细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好 传代培养容易，无需消化分散细胞 培养基中营养成分利用率高l动物细胞培养产酶动物细胞培养方式 贴壁培养l适用于贴壁依赖型细胞 上皮细胞、成纤维细胞 细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂l滚瓶培养系统 结构简单，但l微载体培养系统 由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球 兼具单层培养和悬浮培养的优势 细胞生长环境均一l动物细胞培养产酶动物细胞培养方

15、式 固定化培养l贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用l吸附法 载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒即属此类l包埋法 将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中 细胞不易脱落l固定化培养优点 细胞损伤程度低，可重复使用 产物分离容易l动物细胞培养产酶动物细胞培养过程l种质细胞 体细胞（动物体内组织取出） 杂交瘤细胞l基本工艺过程l动物细胞培养产酶动物细胞培养基l氨基酸：必需氨基酸，如 等，作为碳源和能源利用l维生素：B 族和维 C，可由 提供l无机盐：调节l微量元素：Fe、Cu、Zn 等，可由血清提供l葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸）l激素：胰岛素、生长激素、甾体激素等，可由血清

16、提供l生长因子：如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等，一般来源于血清培养基配制l配制母液，使用前过滤除菌、稀释；Gln 单独配制，冷冻保存l动物细胞培养产酶动物细胞培养的工艺条件及其控制l温度 影响细胞生长，哺乳动物细胞：36.50.25 oC 影响 溶解度，从而影响培养液 值 保持细胞内外等渗状态，一般 700850 kPal溶解氧 供氧不足：细胞生长受抑制 过量供氧：容易产生较多氧自由基，杀伤细胞 用代替空气（空气、O2、N2、）l动物细胞培养产酶动物细胞培养的工艺条件及其控制lpH 值与 CO2 浓度 动物细胞培养液 pH 在 7.6 之间，以 为最佳 最常用的缓冲体系为

17、动物细胞培养时缺少 CO2，培养液中的 HCO3- 会被耗尽； 通常 CO2 浓度维持在 210% 之间 指示剂：酚红CO2 + H2O H+ + HCO3-l动物细胞培养产酶动物细胞培养的工艺条件及其控制lpH 值 HEPES 缓冲体系 HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethanesulfonic acid HEPES is a zwitter-ionic organic chemical buffering agent. HEPES is widely used in cell culture, largely becau

18、se it is better at maintaining physiological pH despite changes in carbon dioxide concentration (produced by cellular respiration) when compared to bicarbonate buffers, which are also commonly used in cell culture. HEPES is like water in that its dissociation decreases as the temperature decreases.

19、This makes HEPES a more effective buffering a g e n t f o r m a i n t a i n i n g e n z y m estructure and function at low temperatures.l动物细胞培养产酶相关问题 为什么培养的细胞要及时传代l传代培养：将原代培养的细胞分离、稀释并接种到新培养基上继续扩大培养的阶段l体外培养的细胞大多具有的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长l当细胞铺满培养器皿表面时，正常细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的、对接触抑制不敏感的细胞会继续生长l如果不及时传代，这些，导致正常细胞的退化转化的细胞就会逐步取代正常的细胞?l动物细胞培养产酶产酶实例 人黑色素瘤细胞培养生产 tPAlTissue plasminogen activator (abbr. tPA) is a protein involved in the breakdown of blood clots. It is a serine protease (EC 3.4.21.68) found on