先天性视网膜变性及功能不良性疾病的分子遗传缺陷研究

1、    先天性视网膜变性及功能不良性疾病的 分子遗传缺陷研究        分类号：R77412；R7711文献标识码：C文章编号：1005-1015(2000)01-0061-031Leber先天性黑(Leber congenital amourosis,LCA)遗传病因新发现本病是一组发病最早、最严重的遗传性视网膜变性疾病。常因视网膜发育缺陷，早期严重变性或功能不良，患者在生后1岁内即有盲目。本病在遗传性视网膜变性中约占5%，主要是AR型遗传。自从1995年LC

2、A的第1个致病基因定位于17号染色体短臂后，至今已发现并定位了5个LCA致病基因，包括最近Stockton等(1998)定位到14q24的LCA3的突变基因。其中3个LCA致病基因已被克隆出，并在LCA患者中检测出突变。这是最近几年本病的分子遗传病因学研究的新发现。第1个引起LCA的突变基因是视网膜鸟苷酸环化酶RETGC基因。1996年，Perrault等首次报告在4个LCA家系的先证者中发现RETGC基因的二种错义突变及二种移码突变(frameshift)。认为视网膜内cGMP合成受损，感光细胞cGMP控制的离子通道(cGMP-gated cation channel)永久关闭是LCA发生的

3、分子遗传病因。第2个引起LCA的突变基因是CRX。Freund等1998年报告了本病患者中检测出CRX基因突变。第3个引起LCA突变基因是RPE65。Dryja等1998年报告约16的LCA患者有RPE65基因的突变。因而RPE65发生突变是导致本病的重要分子遗传缺陷。2先天性静止性夜盲(congenital stationary blindness,CSNB)的分子遗传学研究新进展2.1CSNB基因定位与克隆分离本病为早发、非进行性、主要损害视网膜杆体功能的遗传性变性类视网膜疾病(inherited degenerative retinopathy)。有AD、AR及XL三种类型，有明显的遗传

4、异质性。XL型又分为二种亚型，CSNB1为完全型(complete CSNB)，以杆体功能丧失为特征；CSNB2为不完全型(incomplete CSNB)，以杆体功能降低为特征。CSNB1基因已定位于Xp11.4。最近Beck-Hansen等(1998年)报告将CSNB2基因定位于Xp11.23,并对该基因进行了克隆分离和鉴定。该基因产物为L型电压控制的钙离子通道蛋白-1亚单位(L-type voltage-gated calcium channel,alpha-l-subunit,CACNAlF)。另一个XL型CSNB基因也在1997年(Hardcastle等)定位于Xp11.4(CSNB

5、4),但该基因尚未被克隆。常染色体遗传CSNB基因定位的研究报告较少。本文作者们曾应用连锁分析疗法对1个AD型CSNB大家系进行基因定位的研究，结果发现CSNB与1号染色体的PGD基因位点间可能存在遗传连锁。提示1号染色体可能有AD型CSNB的致病基因。以后Gal等(1994)报告1个丹麦AD型CSNB家系中，CSNB与-L1-iduronidase酶基因位点紧密连锁，而将AD型的一个致病基因(CSNB3)定位于4p16区。AD及AR型CSNB的其它致病基因尚需进一步作染色体定位研究。2.2CSNB致病基因突变的新发现：夜盲的分子机制视紫红质基因突变：自从发现RP患者中视紫红质基因突变后，本文

6、作者们曾采用候选基因方法，应用PCR结合RFLP分析，对1个AD型CSNB大家系的患者检测了视紫红质基因的部分编码顺序，但在所分析的顺序中未发现有视紫红质基因突变。Rao等随后(1994年)报告CSNB患者发生视紫红质基因错义突变，使第90位氨基酸甘氨酸变为天冬氨酸。并认为该突变干扰第296位的赖氨酸与视黄醛生色基团的结合，使视蛋白处于持续激活状态而引起静止性夜盲。-传导蛋白基因及-杆体cGMP-PDE基因突变：Dryia等1996年报告了AD型CSNB的一个大家系的患者发生视网膜杆体传导蛋白亚单位的基因错义突变。使该基因成为第3个引起CSNB的突变基因。CSNB的第2个突变基因是杆体cGMP

7、-PDE 亚单位基因，由Gal等1994年发现在AD型丹麦大家系中发生杂合错义突变。该基因突变多发生于蛋白的N-末端与?-PDE亚单位结合的区域，故突变可阻止暗适应杆体的PDE完全失活，从而使杆体细胞脱敏，对低强度光不反应而产生夜盲。RPGR基因突变：Hermann等1996年报告对RP及XL型CSNB家系患者进行?RPGR基因突变分析的结果显示，RPGR基因的突变即可引起XL型RP，也可导致XL型CSNB的发生。L-型电压控制的钙离子通道蛋白-l亚单位(CACNAlF)基因突变：随着XL型CSNB的致病基因的定位(CSNB2)与克隆，CACNAlF基因便成为研究CSNB分子遗传缺陷的候选基因

8、。1998年Beck-Hansen等报告在20个不完全型XL CSNB家系患者中，发现CACNAlF基因6种不同的突变。这些突变导致部分氨基酸的丢失，使感光细胞电压控制的L-型钙离子通道丧失其功能而引起先天性夜盲。2.3Oguchi病的分子遗传病因和发病机制本病为AR型遗传性静止性夜盲。有特征性眼底灰白色或金辉(golden)色外观，暗适应状态时消失，光照后复现。杆体感光细胞的暗适应过程明显异常，而锥体的则正常。连锁分析已将本病基因定位于第2号染色体长臂的视觉传导阻抑蛋白基因所在的区域。该阻抑蛋白基因自然就成为Oguchi病分子遗传病研究的候选基因。Fuchs等1995年报告所检测的6个Ogu

9、chi病患者中就有5个发生阻抑蛋白基因第309密码的纯合性1个碱基缺失突变，表明该基因突变是Oguchi病的常见遗传病因。Maw等1998年也报告了2个印度Oguchi病患者发生纯合性阻抑蛋白基因的突变，引起该蛋白部分C末端氨基酸缺失，丧失阻抑蛋白结合到磷酸化的视紫红质而熄灭视觉传导的光激活反应的能力，最终导致杆体细胞脱敏而产生夜盲。Oguchi病发生夜盲的特征之一是明显延迟的杆体感光细胞反应恢复期。视紫红质激酶(rhodopsin kinase,RK)是杆体细胞特异的酶，催化视紫红质磷酸化而使其失活，与阻抑蛋白协同作用而熄灭光诱导的感光细胞内信号传递。由于RK功能上的重要性，自从其编码基因被

10、克隆后,RK基因即作为本病的候选致病基因。?Yamamoto等1997年报告了在3个Oguchi病患者中发现3种RK基因突变。其中2个患者发生RK基因第5外显子的纯合缺失突变，导致无功能的RK。另一个患者发生复合杂合突变，同时携带有错义突变及移码突变，致RK蛋白C-末端氨基酸丧失。为研究这些RK突变蛋白的致病机制，Khani等1998年在体外培养的COS7细胞中表达正常及突变的RK蛋白，并测定和比较其酶活性。结果发现突变的RK对视紫红质的光依赖性磷酸化的催化活性缺乏或显著降低，为Oguchi病中RK基因突变致病的发病机制提供了生物化学证据。2.4其它夜盲病的遗传缺陷白点状视网膜变性为遗传性非进

11、行性变性视网膜疾病，以静止性夜盲伴眼底点状黄白色视网膜内沉着物为特征。近年已发现RDS基因突变是部分白点状视网膜变性的遗传病因。?Seeliger等1999年报告RPE进行性萎缩的一家系二个患者发生血浆视黄醇结合蛋白基因的复合杂合错义突变。患者表现为夜盲，有轻度视力下降，进行性RPE萎缩及视网膜电异常。生物化学检查显示血中视黄醇水平降低，仅有正常的1/6。血浆视黄醇结合蛋白缺乏表明RBP基因的突变是引起进行性RPE萎缩和夜盲的遗传缺陷。3遗传性黄斑变性分子遗传学与分子生物学研究的新进展与新概念近年来，遗传性黄斑变性的分子遗传与分子生物学研究进展十分迅速，至今已对9个常染色体遗传黄斑变性的致病基

12、因进行了染色体定位，而且其中3个致病基因已进行了克隆分离及基因产物鉴定。一些在RP患者中发现的基因突变也在遗传性黄斑变性患者中发现。这种致病基因共享(gene sharing)现象是近年视网膜变性疾病研究所带来的新概念。3.1Stargardt黄斑营养不良(macular dystrophy)的研究新进展：基因突变与临床表现Stargardt病为最常见的遗传性青少年发作性黄斑变性，在遗传性视网膜变性疾病中占7。临床特征为发病早，612岁即开始视力严重受损，但周边视觉常不受影响。眼底黄斑区变性，视网膜下RPE有脂褐质样物质积聚。应用连锁分析的方法，近年来已将本病AD型的两个致病基因分别定位于6q

13、11(STGD3)及13q34(STGD2)。而AR型的一个致病基因则定位于1p13染色体区(STGD1),由于该染色体区域含有视网膜感光细胞特异的ABCR基因，故ABCR基因克隆后即成为研究本病遗传缺陷的候选基因。1997年，Allikmets等首次报告在AR型Stargardt黄斑营养不良患者中发现ABCR基因19种不同的突变，提出ABCR基因突变是本病常见的分子遗传病因。1998年，Nasonkin等也在15个Stargardt黄斑营养不良家系中检测出ABCR基因的4种致病性突变，其中2种导致无功能性基因产物。同年Gerber等对ABCR基因50个外显子与内含子交界顺序进行了检测分析，结

14、果发现AR型Stargardt病患者发生ABCR基因拼接位点突变及另外两种新的外显子错义突变。提示本病有广泛的等位基因遗传异质性。Roze等1998年对40个Stargardt病家系患者检测了ABCR基因的全部编码顺序，并进行基因型-表型相关分析，发现引起ABCR蛋白氨基酸丢失的突变均导致早发的黄斑变性。Lewis等1998年对150个AR型Stargardt病进行ABCR基因突变分析及基因型-表型相关性研究，发现大多数错义突变出现在ABCR保守的功能区域。而发生在N-末端1/3的错义突变与本病的早期发作相关。两种最常见的错义突变(G1961E和A1038V)占所检测到的ABCR基因突变中的1

15、8.5。对这150个家系的临床分析还显示本病患者的第1、2级亲属发生老年性黄斑变性的频率比正常人高。因而该作者提出ABCR基因的复合性杂合(compound heterozygous)突变是引起Stargardt病的重要病因，而一些杂合突变则可能增加对老年性黄斑变性的易感性。3.2Sorsby黄斑营养不良(fundus dystrophy,SFD)分子缺陷与遗传类型的新概念SFD为常染色体遗传性黄斑变性疾病，临床表现与老年性黄斑变性相似。3050岁起开始出现中央视觉损害，可伴有夜盲症状。眼底有黄斑区变性表现，RPE萎缩，异常视网膜下沉着物及Bruch膜广泛增厚。常因黄斑下新生血管瘢痕或黄斑萎缩

16、而丧失视力。由于本病表现类似于老年性黄斑变性，故为研究老年性黄斑变性复杂的遗传病因学问题提供了有用的遗传学模型。1994年Weber等应用连锁分析方法在一个AD型SFD大家系中首次将本病的致病基因定位于22q13，使定位于该染色体区的金属蛋白酶-3组抑因子(tissue inhibitor of metalloproteinase-3,TIMP3)基因随即成为研究本病遗传病因的候选基因。随后该作者又报告在2个SFD家系中发现TIMP3基因点突变。1995年Felbor等报告在一个SFD家系中发现TIMP3基因的一种新的错义突变(Ser156Cus)。TIMP3是一种金属蛋白酶的组织抑制因子，视

17、网膜RPE表达并分泌TIMP3到细胞外基质(尤其是Bruch膜)中(extrac ellular matrix,ECM)，与ECM的糖蛋白结合，其N-末端结构区含有蛋白水解酶活性，从而抑制基质中金属酶的活性。TIMP3在ECM的结构造型中发挥至关重要的作用。本病患者中发现的TIMP3基因突变多在C-末端与金属蛋白酶的结合区域，突变通过破坏蛋白的三级结构，影响其与金属蛋白酶的结合或对酶的抑制作用而引起SFD的病理表现。Felbor等1997年对1个原诊断为AR型SFD家系的所有患者进行TIMP3基因顺序分析，发现所有患者均携带有TIMP3的一种新的杂合突变(Gly166Cys)，而非纯合突变。表

18、明该家系的患者为AD型遗传，而非AR型。同时该作者对其它已报告过的AR型AFD家系进行重新分析的结果，也提示其遗传方式很可能为AD型。可见TIMP3基因突变的研究为本病的AD型遗传方式提供了分子遗传学证据。从根本上转变了人们对本病遗传方式的传统认识。3.3Best黄斑营养不良(best macular dystrophy，BMD)致病基因的新发现BMD又叫蛋黄样(vitlelliform)黄斑营养不良，为常染色体显性遗传性早发型黄斑变性。临床特征为早发黄斑区内融合性黄色团块类似蛋黄。RPE萎缩，其内及下面有脂褐质沉着。有进行性视力下降，但检眼镜下的表现常先在出现视觉症状前就观察到。一般认为本病

19、的基本缺陷是在RPE。应用连锁分析的方法已将BMD的致病基因定位于11p12区。近年来，BMD致病基因已被克隆分离和鉴定，其基因产物为视网膜特异性的黄斑营养不良蛋白。该蛋白表达于RPE，其功能可能涉及到视网膜多不饱和脂肪酸的代谢和运转。Petrukhin等1998年报告该基因在本病患者中发生5种致病性突变。同年Marquardt等也报告了在BMD12个大家系的12个先证者中，有10个发生bestrophin基因高度保守的(conserved)氨基酸的错义突变，而另外两个先证者发生缺失突变。这些研究结果表明，bestrophin基因突变是引起本病的遗传病因。3.4锥体营养不良(cone dyst

20、rophy,COD)基因缺陷与发病机制的新认识COD为累积视网膜锥体细胞的遗传性视网膜变性疾病。表现为进行性中央视觉受损，畏光及色觉缺陷，周边视觉和暗视觉不受影响，以AD型及XL型遗传多见。XL型的第1个致病基因定位于X染色体短臂Xp11-4(COD1)。1997年Bergen等应用连锁分析将XL型COD的第2个致病基因定位到X染色体长臂Xq28区。AD型COD的第1个致病基因于1995年定位于17p13。最近用染色体缺失定位方法将AD型COD的另一个致病基因定位于6q25。Payne等1997年报告6号染色体6p21.2区还有一个AD型COD的致病基因(COD3)，并随后对其进行了分离鉴定。

21、其基因产物为鸟苷酸环化酶激活蛋白1(guanylate cyclase activating protein1,GCSP1)。GCAP1具有激活锥体感光细胞的鸟苷酸环化酶的功能，从而促进感光细胞内cGMP的生物合成。Payne等1998年发现1个AD型COD家系的所有患者出现GCAP1基因第99密码的单个碱基错义突变。GCAP1是表达于感光细胞外段的钙离子结合蛋白，突变后可能阻碍其与钙离子结合，从而干扰其激活鸟苷酸环化酶的功能，导致细胞内cGMP降低。Sokal等1998年对该突变蛋白的体外研究，发现突变的GCAP1蛋白对钙离子的敏感性发生了明显的改变，引起生理性暗适应条件下低量但持续刺激鸟苷

22、酸环化酶，使锥体细胞内生理水平的cGMP改变而引起锥体细胞变性。3.5其它遗传性黄斑变性的分子遗传学研究Keen等1994年报告视网膜形营养不良(retinal pattern dystrophy)的患者发生RDS基因第140号密码4个碱基的插入突变是其遗传病因。Felbor等1997年在20个成年型蛋黄样黄斑营养不良患者中检测出RDS基因5种不同的突变，据估计，约有18的本病患者携带有RDS基因点突变。不同种类的突变是造成临床表现变异的原因。Rozet等1998年对15个AR型晚发黄色斑点状黄斑变性(late-onset fundus flavimaculatus,FFM)家系的患者筛选了A

23、BCR基因的全部编码顺序，结果发现所有患者发生影响ABCR蛋白中性氨基酸的错义突变。表明ABCR基因的突变是引起本病发生的病因。4老年性黄斑变性遗传病因研究的重大突破老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是有多种病理生理机制的一组异质性黄斑变性疾病。是西方国家55岁以上者最常见的致盲眼病。一直认为其基本病理缺陷是视网膜RPE功能不良，发病涉及到遗传和环境致病因素。流行病学研究显示吸烟可升高AMD的发病风险。营养学研究提示一些AMD的发生可能与微量元素Zn及Se等以及维生素不足有关。临床上，AMD分为两种类型。干性AMD占约80，特征性表现为包括RPE内或其下细胞碎屑，RPE色素不规则或RPE萎缩；湿性AMD特征性表现有浆液性RPE脱离及脉络膜黄斑下新生血管形成。该型发病占20。AMD中遗传致病因素的作用早在九十年代初就已引起了眼科和遗传学家的关注。1994年Heiba等报告对年龄相关黄斑病变(age-related maculopathy)进行遗传学上的同胞相关及分离分析的结果，发现遗传因素，尤其是单个主基因是本病发生的重要病因。1997年DeLaPaz等对有3个以上年龄相关黄斑病变患者的家系(即隐性遗传型AMD)进行临床遗传学分析，发现本病有遗传相关的表型异质性(phenotypic heterogeneity)。然而