HGH发酵和纯化工艺

1、资料项目名称：hGH原液生产工艺的研究资料第一部分：发酪工艺研究重组hGH发酵工艺研究分：实验室摇瓶研究及上罐工艺研究。实验室摇瓶研究的主要目的是通过对rhGH的一系统列优化表达实验，为上罐发酵确定了基本工艺条件；然后该工艺又通过在发酵罐水平（5L）进行了不断地优化与验证，最终确定了本工程菌稳定的发酵工艺，rhGH的表达量每升培液可达近2g/L0该工艺经过连续多批中试规模（5L体积），证实工艺稳定。1、rhGH表达工艺的实验室研究在尽可能与发酵罐条件相近的条件下，用小摇得到一定的实验数据，为后期中试上罐研究提供一定的数据参考。以500ml三角烧瓶为主，个别实验自选。批内2次，批间1次即可。实验

2、对象均采用经筛选最稳定高表达EB0200901号菌种。1.1最佳诱导pH方法：取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:10的比例二级接种于50ml培养基的500ml三角烧瓶中（每个条件有副管），培养24hr左右，1%甲醇诱导，诱导阶段的pH需按下表调节（因为是BMGY,所有在BMMY培养基中直接调节pH）。诱导24hr取样，测定OD及pH,再加1%甲醇继续诱导。共诱导48hr。诱导前、诱导不同时间样品检测SDS-PAGE。实验编号实验条件1pH3.02pH4.03pH5.04pH6.05pH7.097kD66kD43kD31kD20kDHGH.14kD123456789

3、104:Marker（从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD）1：诱导前摇瓶上清液2、3、5、6、7:依次为pH37条件下诱导24hr摇瓶上清液（pH1.0/点）8、9、10:依次为pH35条件下诱导48hr摇瓶上清液（pH1.0/点）图1.摇瓶pH优化电泳图结论：由于摇瓶实验采用的培养基于上罐不一样，并且实验中对pH的控制不十分精确，故认为HGH在pH=4.0附近时表达较好。1.2保护剂类型及浓度方法：取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:10的比例二级接种于50ml低盐培养基（用氨水调节pH为6.0）的5

4、00ml三角烧瓶中，培养24hr左右，1%甲醇诱导。按下表添加不同的保护剂，诱导24hr取样，测定OD及pH,共诱导48hr。诱导前、诱导不同时间样品检测SDS-PAGE。实验编号（副管以表示）实验条件1CA0.5%21%3Yeastextract0.5%41%5Peptone0.5%61%7空白对照一8一97kD66kD43kD31kD20kDHGH14kD1234567891011121314151:诱导前摇瓶上清液；2：空白对照诱导48hr;4：Marker3、5、6、7：依次为添加Yeastextract诱导24hr和48hr摇瓶上清液（6和7为重复）8、9、10、11:依次为添加CA

5、诱导24hr和48hr摇瓶上清液（10和11为复）12、13、14、15:依次为添加Peptone诱导24hr和48hr摇瓶上清液（14和15为重复）图2.摇瓶补料优化电泳图结论：首先，三种保护剂中Yeastextract效果较好，1%浓度也比0.5%浓度好。另外，诱导48小时能够提高表达量，可作为上罐发酵指导。2. rhGH的发酵罐工艺研究（中试研究）初步完成中试实验，得到一定的实验数据，为后期中试稳定高表达工艺提供一定的数据参考，为以后进一步优化中试工艺提供依据。以5L发酵罐，工作体积为3L。实验对象均采用经筛选最稳定高表达的EB0200901号菌种。2.1 毕赤酵母发酵经典方法初步鉴定方

6、法：取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:10的比例二级接种于250mlBMGY的1L三角烧瓶中，培养48hr左右，上罐发酵，pH5.0（用氨水调节卜温度30C、DO>35%,待溶氧上升后以1015转度流加50%甘油300ml,待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度1开始诱导，逐渐提速，诱导后每隔4hr留样离心-20C冻存，诱导36hr结束。样品检测SDS-PAGE、蛋白含量。rhGH123456789103:Marker（从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD）1：诱导前发酵上清液210：依次为不同诱导

7、时间发酵上清液（最长36hr）图3.发酵参数优化前电泳图结论：通过经典的方法，我们发现HGH能够有一定的表达，但表达水平较低，说明此项目的发酵工艺还需要进行不断地摸索，优化发酵工艺路线，提高表达水平。2.2 最佳pH方法：取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:10的比例二级接种于3瓶250mlBMGY的1L三角烧瓶中，培养48hr左右，上罐发酵，初始pH5.0,诱导pH（如下表）、温度30C、DO>35%,待溶氧上升后以1015转度流加50%甘油300ml,待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度1开始诱导，逐渐提速，诱导后每隔4hr留样离心-20C冻存，诱导48h

8、r结束。样品检测SDS-PAGE、蛋白含量。发酵罐编号实验条件1pH:3.52pH:4.03pH:4.51、17:Marker（从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD）28:依次为pH3.5下诱导0、8、16、24、36、44、48hr916:依次为pH4.0下诱导0、8、16、24、36、44、48hr1825:依次为pH4.5下诱导0、8、16、24、36、44、48hr图4.发酵pH参数优化电泳图结论：从电泳结果来看，与摇瓶结果有差异的是：最佳诱导pH=3.5o根据文献资料及经验，可能选用更低的pH（3.0）可能会得到更好的表达

9、水平，下一步将采用更低的pH进行对比。2.3 诱导最佳pH验证方法：取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:10的比例二级接种于2瓶250mlBMGY的1L三角烧瓶中，培养48hr左右，上罐发酵初始pH5.0,诱导（如下表）、温度30C、DO>35%,待溶氧上升后以1015转度流加50%甘油300ml,待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度1开始诱导，逐渐提速，诱导后每隔4hr留样离心-20C冻存，诱导48hr结束。样品检测SDS-PAGE、蛋白含量。发酵罐编号实验条件（诱导前菌湿重）1pH3.02pH3.512345678910123456789101112131

10、41516171819201、13:为marker（从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD）210:依次为pH3.0下诱导0、7、12、24、36、40、44、48hr1120（除13）:依次为pH3.5下诱导0、7、12、24、36、40、44、48hr图5.发酵pH参数优化电泳图结论：从电泳结果上来看，诱导pH3.0表达水平明显好于pH3.5,表明采用更低的诱导pH是完全可行及正确的。另外，由于保护剂及诱导pH选择所解决的主要问题都是防止目的蛋白的降解，而我们仅通过改变诱导pH就达到了较高的表达水平，完全满足了工艺要求，考虑到这点

11、及成本方面的原因，故原先准备摸索的保护剂实验可不予进行。2.4 发酵工艺稳定验证：方法：取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:10的比例二级接种于250mlBMGY的1L三角烧瓶中，培养48hr左右，上罐发酵初始pH5.0,诱导pH（下表）、温度30C、DO>35%,待溶氧上升后以1015转度流加50%甘油，待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度1开始诱导，逐渐提速，诱导后每隔4hr留样离心-20C冻存，诱导48hr左右结束。样品检测SDS-PAGE、蛋白含量。典型电泳图12345678hGH发酵结果SDS-PAGE电泳图I.Marker（从上到下分子量为97.4

12、KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD）2.诱导前38:诱导848小时，每隔8小时样品结论：通过本次实验，基本确定并验证了hGH的发酵工艺。在此工艺条件下，hGH的表达水平稳定，表达量高，最终样品扫描结果显示，目的蛋白的表达量在60%以上，总量达到3g/L发酵液，而且没有明显的降解条带，这些都为纯化提供了极大的方便。因此，可以说目前的发酵工艺是稳定、成熟而且高水平的。第二部份：rhGH纯化工艺研究成熟人生长激素是一种由191个氨基酸组成的非糖基化蛋白质，hGH含有两个分子内二硫键，4个半胱氨酸，这两个分子内次级键对于形成正确的球性构象起了重要作用。具分子量为

13、22kD01、纯化实验室研究1.1 Tube小试：通过使用1.5mltube装载0.5ml各种不同层析介质（Q、DEAE、Heparin、CM、Phenyl）,使用各种不同pH缓冲体系、离子强度，摸索最佳层析初始条件。介质pH缓冲体系离子强度Q、DEAEPhenyl、CM、Heparin4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0醋酸、柠檬酸、PB、Tris-HCl10mM40mM50mM如选择CM-SerpharoseFF（Pharmaci啾层析介质，把样品的pH保持在rhGH的等电点之下，实验发现载样量很低，目的蛋白收率很低。使用heparin、phenyl这两种介质不管在等电点之上还是

14、之下，都出现载量低，目的蛋白收率低的情况。如选择Q-SerpharoseFFg£DEAE-Serpharose（Pharmacia）t层析介质，把样品的pH调至rhGH的等电点5.0之上，对rhGH载样量上有所提高，目的蛋白回收率也较高。对比这两种阴离子介质，发现Q在载量上更有优势。由于有文献报道rhGH在pH8.0之上容易产生酰胺化，而在Ph3.0之下时不利于该蛋白的活性。选才?QsepharoseFF做层析介质，在Ph6.0-7.5PB缓冲体系下载量高，并且分离效果好。1.2 1ml预装柱、10-30ml填充柱小试借鉴tube小试结果，进行1ml预装柱、10-30ml填充柱柱小试

15、实验，进-步摸索Q并确定最佳层析条件（缓冲液浓度、流速、上样条件、载量、洗脱条件）。使用1ml预装柱进行柱层析实验，考察不同pH缓冲液下对目的蛋白结合的影响。结果表明，缓冲体系为10mMPB,Ph7.5时蛋白的结合效果最佳采用0.1MNaCl阶段洗脱可以较好洗下目的蛋白，提高目的蛋白纯度。031010Q01:1_UV1_280nm031010Q01:1_UV2_260nm031010Q01:1_Cond031010Q01:1_Conc031010Q01:1_pH031010Q01:1_LogbookmAUmAU40030020010030%B100%B10%B20%B1wo1o/wo22w01

16、00400500600m"97kD_66kD一43kD一31kD一20kD一14kD一1234514151上样前2穿透峰4为10%B洗下蛋白，5为10%B峰尖通过实验我们选择了最佳的第一步层析条件：介质为Q-SerpharoseFF缓冲体系为10mMPB,Ph7.5,采用10%SolutionB阶段洗脱。通过小试进一步摸索了第二步层析的一些基本条件：介质洗脱条件缓冲体系离子强度Q0-100%B,10CVPB,Ph7.510mMPhenyl100%B直接洗脱PB,Ph7.510mMb1M(NH4)2SO4mAU1234567840.030.020.010.00.0hGH小试Q-seph

17、aroseFF柱层析结果1-7为峰1不同部分洗脱，8为峰2高盐洗脱部分将第一步层析洗脱得到的含目标蛋白的样品，再进行Q-sepharoseFF柱线形洗脱，从色谱图和电泳图看，杂质和目标蛋白没有明显的分离效果，主要集中在一个洗脱峰里。但是将第一步层析洗脱得到的含目标蛋白的样品经过phenyl柱的分离后，得到了纯度为98%以上的目的蛋白。见下图031016phenyl01:1_UV1_280nm031016phenyl01:1_UV2_260nm031016phenyl01:1_Cond031016phenyl01:1_Conc1234567891011rhGH1：proteinMarker;2：上样前；3-6：峰1;7：峰2;8：峰2峰3交叉；9:峰3;10:峰3峰尖；11:峰3后半部分通过以上小试结果初步确定了一些基本条件：将3K超滤后的样品进行第一步层析时，选用Q-sepharoseFF为层析介质，10mMPB,Ph7.5为上样缓冲液，采用10%SolutionB阶段洗脱目的蛋白；在第二步层析时，选用phenyl-sepharoseFF为层析介质，10mMPB+1M(NH4)2SO4,Ph7.5为上样缓冲液，并用10mMPB,Ph7.5作为洗脱缓冲液，经过两步层析后rhGH的纯度达到98%以上。2.rhGH纯化中试研究：借鉴实验室研究结果，进行层析条件的放大及优化，初步确