烟草中非挥发性有机酸及高级脂肪酸的快速分析方法

1、烟草中非挥发性有机酸及高级脂肪酸的快速分析方法沈 轶 刘百战 王 瑾 孙凯健 上海烟草（集团）公司摘 要 烟草中的有机酸及相关衍生物是影响烟草香味的主要化学成分，对于其中非挥发性有机酸及高级脂肪酸的分析一直存在着样品处理复杂、稳定性差等不足。本文利用对烟草制品进行连续甲酯衍生化、三氯甲烷萃取等步骤，利用GC/FID对其中的非挥发性有机酸及高级脂肪酸进行定量分析，结果表明，该方法重复性、回收率等良好，具有一定的应用价值。关键词 甲酯衍生化非挥发性有机酸 高级脂肪酸植物中存在多种有机酸，烟草也不例外。作为影响烟草香味的主要化学成分，对其的研究对提高烟草品质显得十分重要1。一般认为，烟叶中有机酸可分

2、为挥发性和非挥发性（除氨基酸外）以及部分高级脂肪酸，相对含量较高的多为非挥发性有机酸中的二元酸和三元酸，以苹果酸、柠檬酸、草酸和丙二酸的含量相对较高（在烤烟中约占518）2。以往研究表明，一般情况下，这些非挥发性有机酸的含量高意味着香烟灰份含量大，吃味差，即与燃吸品质呈反关系。而对于高级脂肪酸，饱和高级脂肪酸及其甲酯类能使烟气柔滑，但不饱和高级脂肪酸及其甲酯在抽吸时会产生己醛、己烯醛等青杂气物质。故对于烟草中非挥发性有机酸、高级脂肪酸及其衍生物的测定已逐渐成为国内外烟草行业的质量控制内容。对于非挥发性有机酸的分析检测，一般可以采用高效液相色谱、离子色谱色谱、毛细管电泳等液相分离分析技术进行分析

3、检测，但由于烟草中的化学成分过于复杂，采用液相分离和分析技术要求较高，前处理的条件和过程并不简易26。另外，由于烟叶中有机酸部分是游离存在的，大部分是以碱金属盐或有机碱盐的形式存在，采用衍生化处理，再进行气相色谱分离分析的方法可以使检测的准确性更高，且采用此技术还可以对烟草中的高级脂肪酸进行分离分析。现阶段的对于非挥发有机酸和高级脂肪酸的衍生化方法主要分为硅烷化、甲酯化两大类，可采用的衍生化试剂也相对较多，但都存在前处理过程复杂、衍生化试剂不稳定、试剂耗用大等不足之处711。本文利用H2SO4-甲醇试剂，对烟草中的非挥发有机酸和脂肪酸进行甲酯衍生化，其主要原理是利用在酸性条件下的酯化反应和置换

4、反应（如图1），使有机酸全部转变成甲酯类化合物，然后用氯仿萃取、离心分离、利用GC/FID进行检测，取得了较好的定量效果图1 在H2SO4催化下的有机酸类物质的酯化和置换反应1 材料与方法1.1 仪器和试剂Agilent6890气相色谱仪；氢火焰检测器； 氯仿、甲醇（色谱纯，均为Scharlau公司）；硫酸（AR，太仓教育试剂厂）；乳酸、丙二酸、乙酰丙酸、己二酸（AR，TCI公司）；草酸、苹果酸、柠檬酸（>99，ACROS公司）；棕榈酸甲酯（>99.5%）、硬酯酸甲酯（>97.9%）（Chem Service公司）；亚油酸甲酯、油酸甲酯（>98，Sigma公司）1.2

5、溶液的配制（1）10 H2SO4-CH3OH溶液。在冰冷却和搅拌条件下，将100ml浓H2SO4缓慢加入900mlCH3OH溶液中，摇匀备用。（2）己二酸内标溶液。称取800.0mg己二酸，加入100ml容量瓶中，用CH3OH定容至刻度。（3）标准溶液。按表一所示准确称取标样于100ml容量瓶中，用CH3OH定容至刻度。表1 标准溶液的组成乳酸草酸丙二酸乙酰丙酸苹果酸mg100.0500.0100.0150.02000.0柠檬酸棕榈酸甲酯亚油酸甲酯油酸甲酯硬酯酸甲酯mg400.0350.0120.0180.0100.01.3 样品的甲酯化 称取100mg已粉碎的烟草样品于具Teflon旋塞20

6、ml试管（自制）中，加入100µl己二酸内标溶液，加入2ml 10（V/V）硫酸甲醇溶液，振摇5min，室温放置过夜，进行甲酯化反应。然后加入5ml去离子水，5ml氯仿，萃取后离心（2000rpm），取下层清夜进样。1.4 GC分析条件 DB-5（60m×0.32mm×0.25µm）毛细管色谱柱（J&W公司）；进样量：1µL，不分流进样方式；进样口温度：250；载气：He，2.2ml/min；程序升温：45下保持2min，然后以6/min的速率升至180，再以10/min的速率升至260，保持10min；检测器：FID；检测器温度：30

7、0。2 结果与分析2.1 工作曲线的绘制分别取25、50、100、200、500µL加入具Teflon旋塞试管中，按1.3所述甲酯化程序对其进行甲酯化后，进行GC/FID分析，所得色谱图见图2。根据保留时间定性、内标法定量原理得到各种酸的回归方程及其相关参数，回归方程以Area RatioA×AmtRatioB表示，Area Ratio为（待测酸峰面积/内标峰面积），AmtRatio为（待测酸含量/内标己二酸含量），具体数据见表2。可见所有标样的工作曲线均具有良好的线性，相关系数>0.999。图3列举了草酸和硬酯酸甲酯的工作曲线。根据工作曲线可以直接得到样品中的非挥发

8、有机酸的含量，高级脂肪酸的实际值可以由高级脂肪酸甲酯的量换算得出。另外，根据以往的经验12 ，烟草中含有一定量的亚麻酸，而亚麻酸甲酯化后生成亚麻酸甲酯，其色谱峰响应时间与油酸甲酯接近，无法分开，因此本文以油酸工作曲线计算这2种酸的重量。2.2 重复性取同一烟草样品，按1.3所述方法进行4次有机酸测定，得到重复性测试结果，见表三。由表3可知，除柠檬酸、油酸和亚麻酸外，其他酸类成分的RSD均小于5，柠檬酸由于含有三个羧基，其衍生化过程存在一定的位阻效应；油酸和亚麻酸由于峰的分离较困难，所以它们的测试RSD略大于5，但是还是能满足较为可靠测试的需要的。表2 工作曲线参数和相关系数化合物AB相关系数乳

9、酸0.02602082-0.01702340.99995草酸0.2450445-0.01251770.99998丙二酸0.07335395-0.01008460.99998乙酰丙酸0.17410687-0.01368020.99994苹果酸0.68883045-0.28979040.99999柠檬酸0.2365718-0.16262160.99999棕榈酸甲酯0.732931010.00283410.99990亚油酸甲酯0.20098103-0.0648930.99999油酸甲酯0.30244848-0.03468870.99993硬酯酸甲酯0.23802292-0.02168370.9999

10、4图2 标准溶液（上）和烟草样品（下）中非挥发有机酸和高级脂肪酸甲酯化后的气相色谱图1-乳酸；2-草酸；3-丙二酸；4-乙酰丙酸；5-苹果酸；6-柠檬酸；7-棕榈酸；8-亚油酸；9-油酸亚麻酸；10-硬酯酸；IS-内标（己二酸）图3 草酸和硬酯酸甲酯测试工作曲线表3 重复性测试结果mg/g乳酸草酸丙二酸乙酰丙酸苹果酸柠檬酸棕榈酸亚油酸油酸+亚麻酸硬脂酸10.9510.701.200.8253.917.062.011.742.710.5221.0010.901.250.8257.567.772.081.852.980.5331.0010.811.240.8357.907.942.061.893.

11、090.5440.9710.871.240.8059.348.152.001.833.050.53RSD/%2.210.801.741.794.046.081.933.345.721.992.3 回收率 采用标样加入法测定方法的回收率，即在已知烟草非挥发酸和高级脂肪酸含量的烟草样品中分别加入不同量的混合标样，而后进行甲酯衍生化和GC/FID分析，并根据测定量、加入量和原含量计算回收率，结果见表4。由表4可知，这10种酸的回收率在93.1118.3之间，说明本法对这些酸成分的衍生化和萃取较为完全，满足定量分析要求。表4 非挥发有机酸和高级脂肪酸的回收率乳酸草酸丙二酸乙酰丙酸苹果酸93.195.7

12、96.599.5110.5柠檬酸棕榈酸亚油酸油酸亚麻酸硬酯酸118.396.9106.6110.199.63 结论简化了烟草中非挥发有机酸和高级脂肪酸的甲酯衍生化、气相色谱分析方法。本方法衍生化试剂消耗量小，所有操作均在同一反应试管中完成，操作简便、准确度高、重复性好，适用于大批量样品的分析。参考文献1 T.C. Tso, Production, physiology, and biochemistry of tobacco plant, IDEALS, Inc., Beltsville, MD, 19902 J. Qiu, X. Jin, Development and optimizati

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