核受体免疫组织化学染色时抗原修复方法的选择-

1、核受体免疫组织化学染色时抗原修复方法的选择来源:233网校论文中心 2011-01-06 10:26:00 阅读:10编辑:studa20作者:张富军,任娟,王飞苗,吕社民,李冬民【摘要】目的探讨不同抗原修复法对DA.1U大鼠肝组织内核受体检测结果的影响。方法应用微波修复法、高压修复法、酶修复法和高压加酶修复法对DA.1U大鼠肝组织切片进行修复,然后进行免疫组化染色。结果 DA.1U大鼠肝组织内核受体LXR 、LXR 、PPAR 和FXR经高压抗原修复后,染色阳性强度较其他修复方法明显增强,而且定位较佳。结论在核受体免疫组化染色中高压抗原修复法染色效果优于其他抗原修复法。【关键词】核受体;免疫

2、组织化学;抗原修复ABSTRACT: Objective To explore the effects of different methods of antigen retrieval on the results of immunohistochemical staining of nuclear receptors. Methods Antigens were retrieved by using microwave oven, autoclave, enzyme and autoclave plus enzyme, respectively, in liver sections fro

3、m DA.1U rats, followed by immunohistochemical staining. Results After antigen retrieval with autoclave, the positive staining intensity of nuclear receptors LXR , LXR , PPAR and FXR in the liver sections from DA.1U rats was enhanced obviously, and the location of nuclear receptors was better by usin

4、g this method than the others. Conclusion In the immunohistochemical staining of nuclear receptors, using autoclave to retrieve antigens is the best method.KEY WORDS: nuclear receptor; immunohistochemical staining; antigen retrieval核受体在生物体内广泛分布,与配体结合后活化,调控基因的表达,在机体生长发育、新陈代谢等生理过程中发挥重要作用。核受体LXR 、LXR 、

5、PPAR 和FXR在糖、脂代谢调控中起重要的作用,参与2型糖尿病的发生发展。免疫组织化学染色是根据抗原与抗体特异性结合的原理,用标记的特异抗体对组织细胞内抗原进行定位、定性及定量研究。甲醛溶液固定导致许多抗原决定簇被掩盖,不能与抗体很好结合。核受体位于核内,镜下观察染色结果时,若隐若现,抗原表达不均匀。为了解决该问题,使抗原决定簇能很好的暴露出来,我们采取了微波修复法、高压热修复法和酶修复法等。抗原修复方法对DA.1U大鼠肝组织切片进行修复;比较分析不同抗原修复法对DA.1U大鼠肝组织内核受体免疫组化染色结果的影响。1 材料与方法1.1 仪器与试剂Olympus DP71图像分析仪。LXR 、

6、LXR 、PPAR 和FXR抗体购自Abcam公司;免疫组化(SP法试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。1.2 组织材料病理切片来自DA.1U大鼠糖尿病模型肝组织,经40g/L多聚甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,5m厚,每个蜡块各切5片。1.3 抗原修复组织切片常规脱蜡至水,3%(体积分数H2O2灭活内源性过氧化物酶,0.02mol/L PBS冲洗后抗原修复。将切片插入塑料切片架,放置于盛有150mL 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0的容器中,置微波炉内加热1min 40s,使缓冲液温度保持于82以上。取出切片架,室温放置3min,然后将切片架置于凉水中冷却15min。将切片插入

7、金属架,放置于盛有400mL 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0的烧杯中,将烧杯放入高压锅内,盖锅、压阀。待煮沸喷气后,计时23min,然后将压力锅端离电炉,自然冷却20min后取出切片。将复合消化液滴加于切片组织上并完全覆盖,将切片放入湿盒内,37温箱中消化10min。按上述方法高压修复后取出切片,蒸馏水冲洗,PBS洗2min3次后,将复合消化酶滴加于切片组织上并完全覆盖,将切片放入湿盒内,37温箱中消化3min。1.4 免疫组织化学染色经上述步骤处理后的切片均用PBS冲洗3次,各5min;滴加正常动物血清封闭液,室温放置20min,甩去多余液体;每张切片滴加抗30L,4过夜,次

8、日37复温45min,PBS冲洗2min3次;每张切片滴加生物素标记抗30L,37 20min,PBS冲洗5min3次;滴加链酶亲和素 过氧化物酶复合物, 37 20min,PBS冲洗5min3次;DAB H2O2显色,在显微镜下控制染色程度,自来水冲洗10min;苏木素复染。以PBS替代抗作为阴性对照。2 结果核受体LXR 、LXR 、PPAR 和FXR均表达于核内,以核内出现棕黄色或棕色颗粒为阳性。对4种核受体抗原采用4种抗原修复方法,以PPAR 为例说明(图1:阴性对照,未见特异性免疫染色,肝细胞核均被苏木素染为蓝色;不修复,可见肝细胞核均为蓝色,未见棕色颗粒;微波修复,在少数肝细胞质中

9、出现棕色颗粒,核仍为蓝色,定位不准确;酶修复,采用复合消化液修复肝组织后,细胞核未被染色;高压修复,该法修复肝组织切片后,染色强度明显强于其他修复法,而且背景清晰;高压加酶修复,通过该法修复后,肝组织染色强度强,但是组织碎裂,且背景深。LXR 免疫组化染色结果见图2。3 讨论甲醛固定时,蛋白质的自由氨基与醛基形成羧甲基,或蛋白质氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键,使得蛋白质抗原决定簇部分被封闭,无法表达出来,影响免疫组化的结果1。抗原决定簇是否充分暴露,是决定免疫组化结果的关键因素。为了更好地暴露抗原,目前世界公认的方法就是进行抗原修复。抗原修复方法主要包括热修复和酶修复。高温抗原修复方法机理

10、复杂,高压可使交联断裂或折叠的肽链解开,从而暴露抗原决定簇2;微波场内离子或极性分子直接碰撞,使扭曲、折叠的异常结构恢复正常3。热修复法比较稳定,因高压修复法避免了外界环境对温度的影响,在染色强度和重复性方面优于微波修复法4。酶修复法则是通过溶解抗原表面的变性蛋白使之暴露,但是酶消化时间因组织不同而异,不易控制,结果不稳定。在抗原修复过程中仍需注意:抗原修复液的选择:在修复过程中应加入足够的修复液防止干片,一般选用柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0,它适用于大多数抗原,修复效果佳。抗原修复温度及时间的选择:有研究表明,温度达到92以上才能使甲醛固定的蛋白抗原修复,一般应保持在9298。有效温度持续时

11、间长短应因抗原修复方法不同而不同,一般微波修复法温度不好控制,抗原修复液易沸腾,容易脱片,应严密观察;高压修复时,盛有抗原修复液的烧杯隔水放在高压锅内,压阀喷气24min,温度容易控制,效果佳。抗原修复液应自然冷却:抗原修复持续高温过后应自然降温,慢慢恢复蛋白原构型。抗原修复作用广泛,不仅可以用于免疫组化,尚能用于末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(Tunel、原位杂交(ISH和荧光原位杂交(FISH的检测,以及树脂包埋的半薄和超薄切片的免疫组化检测和非交联剂固定的活细胞和细胞涂片中抗原的检测等领域。本试验尝试了4种抗原修复方法,结果表明在核受体免疫组化中,高压抗原修复法结果稳定,优于酶修复法及微波修复法,染色较强,定位准确,背景清晰。所以,应当根据不同的抗原特征,合理选择抗原修复方法。【参考文献】1倪灿荣. 病理学技术 M. 北京:人民卫生出版社, 2000:366 368.2NORTON A, JORDAN S, YEOMANS P. Brief, high temperature heat denaturation (pressure cooking: a simple and effective method of antigen retrieval for routinely p