探讨兔脂肪源性干细胞在颅骨缺损修复中的应用

1、探讨兔脂肪源性干细胞在颅骨缺损修复中的应用    摘要： 目的: 探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞在修复兔颅骨缺损中的应用前景. 方法: 提取兔脂肪源性干细胞，成骨诱导并检测，将成骨诱导前后的脂肪源性干细胞种植到自制松质骨支架上，将细胞支架复合物和单纯支架材料分别移植至兔颅骨缺损部位. 结果: 与未诱导的脂肪源性干细胞复合支架、单纯支架以及空白处理对比，成骨诱导后的脂肪源性干细胞复合支架修复骨缺损面积最大，差异具有统计学意义（P<0.05）. 结论: 脂肪源性干细胞可作为骨组织工程的种子细胞，其成骨诱导后与自制松质骨复合植入体内，能显著促

2、进骨缺损的修复. 关键词：  脂肪源性干细胞；异种松质骨；支架材料；骨代用品；生物医学工程；成骨诱导；种子细胞     0引言    如何获得充足的种子细胞是长期以来限制组织工程研究的瓶颈，骨髓基质干细胞尽管已被广泛应用于组织工程研究，但由于其干细胞含量过低、骨髓抽取量有限以及对患者造成的创伤等，使其广泛应用到受限. 2001年Zuk等1从脂肪组织中成功提取了干细胞，并成功诱导其向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化. 我们将成骨诱导的脂肪源性干细胞（adiposederived stem cells，ADSCs

3、）与异种松质骨支架复合，移植至兔颅骨缺损部位，以探讨成骨诱导脂肪源性干细胞修复骨缺损的应用前景.    1材料和方法    1.1材料新西兰大白兔12只，4 mo龄，体质量2.02.2 kg（第四军医大学实验动物中心）；Dolbecco改良的Eagle培养基（DMEM），胎牛血清（FBS），地塞米松，抗坏血酸，HanksWay ANOVA检验. P<0.05为差异具有统计学意义.    2结果    2.1细胞培养原代脂肪源性干细胞呈梭形，在甘油磷酸钠，地塞米松，抗坏血

4、酸的诱导下，能向成骨方向分化（图 1A）. 诱导2 wk后茜素红染色阳性，提示有钙结节形成(图1B). ALP活性检测结果显示，成骨诱导6 d后，支架+成骨诱导ADSCs组与对照组间差异具有统计学意义（P<0.05，表1），支架+成骨诱导ADSCs组的ALP活性明显高于单纯支架组.表1不同时期对照组和成骨诱导组碱性磷酸酶含量  2.2电镜观察电镜观察结果显示，成品松质骨表面粗糙凸凹不平，ADSCs及成骨诱导后的ADSCs均能粘附在其表面并伸入裂隙中生长，呈现梭形，表面有突起伪足（图2）. &nb    sp; 

5、 2.3术后大体观察手术植入后大体观察，家兔手术区域无红肿、渗出，无异物排出，给予抗感染治疗，家兔饮食、活动良好.    2.4定量分析术后14 wk取材，X线摄片显示缺损部位有不同量的骨组织形成. 对照组、单纯支架组和支架+ADSCs组骨缺损部位成骨面积差异无统计学意义（P>0.05）. 支架+成骨诱导ADSCs组的成骨面积大于其余3组，差异具有统计学意义（P<0.01，表2），其余各组间成骨面积无显著性差异.表2兔颅骨缺损修复的定量分析    2.5组织学分析HE染色可见各组均有不同程度的新骨形成，尤以支架+成骨诱导A

6、DSCs组新骨形成最为显著. 支架+成骨诱导ADSCs组，支架+ADSCs组和单纯支架组均可见支架材料不同程度被吸收，沿支架有新骨形成，支架吸收、新骨形成均以支架+成骨诱导ADSCs组最为显著（图3）.    3讨论    ADSCs是一种新的干细胞，能够向骨、软骨、心肌细胞等多个方向分化1. ADSCs可经抽脂术获得，安全性较高，不良反应少，患者容易接受， ASCs在体外增殖和诱导时对血清的要求较低2-5.    在抗坏血酸、地塞米松、磷酸甘油钠的诱导下，ADSCs的ALP的表达增多，诱导2 wk后，茜

7、素红染色阳性，提示有钙结节的形成，而非诱导组茜素红染色为阴性，提示ADSCs向成骨方向的分化. 2003年Lee 等6将ADSCs应用于体内成骨研究，将成骨诱导后的ADSCs复合多孔PLA材料埋植于大鼠皮下，8 wk后有骨组织生成. 将成骨诱导的ADSCs与可吸收材料相复合，有望用于修复骨缺损. Alejandro等3将成骨诱导后的ADSCs用于修复大鼠腭骨缺损，12 wk后，在缺损部位发现了新生的骨组织. Stefan等7将ADSCs与自体松质骨颗粒和纤维蛋白胶相混合，成功用于修复一7岁女孩大面积颅骨缺损，尽管还不能确定这其中ADSCs起了多大的作用，但这一临床病例确实令关注ADSCs的人们

8、大受鼓舞.    异种骨来源广泛，没有传播疾病的潜在危险性，且因骨组织结构在不同种属动物间存在高度同源性，其骨小梁、小梁间隙、空隙率、骨内管腔系统及骨盐支架的三维结构有利于组织细胞粘附、生长，并为细胞外基质的分泌提供宽大的内部空间及表面积，加之其无机成分主要是羟基磷灰石， 与人骨成分相同， 因此，异种骨结构植入体内后易被宿主组织细胞接近而发生爬行替代及生物降解，应当是较理想的载体材料8-10.    我们将自制脱钙、去抗原后的异种松质骨用于骨组织工程的支架材料，将其与ADSCs相复合，用于修复骨缺损. 结果表明，脱钙、去抗原后的异种松

9、质骨具有良好的生物相容性，成骨诱导前后的ADSCs均能在其表面良好生长，植入体内后，能够被逐步吸收. 脱钙、去抗原后的异种松质骨可用作骨组织工程的支架.    我们所用细胞为自体细胞，最大程度减小了因机体免疫力的不同而对试验结果造成的影响. 植入体内12 wk后，取材X线摄片结果显示，成骨诱导后的ADSCs复合异种松质骨支架后能够更好地修复骨缺损，而未诱导的支架+ADSCs、单纯支架、对照组3组间差异无统计学意义. HE染色结果显示支架+成骨诱导ADSCs组，支架+ADSCs组和单纯支架组均可见支架材料不同程度被吸收，沿支架有新骨形成，支架吸收、新骨形成，但均以支

10、架+成骨诱导ADSCs组最为显著. 成骨诱导后的ADSCs促进了骨缺损的修复.【参考文献】  1 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell 2 based therapiesJ. J Tissue Eng, 2001, 7(2):211-228.2 Jason R, Dudas BA, Kacey G, et al. The osteogenic potential of adiposederived stem cells fo

11、r the repair of rabbit calvarial defectsJ . J Ann Plast Surg， 2006，56(5): 543-548.3 Alejandro CJ, James A, Lee MD, et al. Repair of palatal bone defects using osteogenically differentiated fatderived stem cellsJ. J Plastic Reconstruct Sur, 2006,117(3):857-863.4 Liou EJ, Chen PK, Huang CS, et al. Int

12、erdental distraction osteogenesis and rapid orthodontic tooth movement: A novel approach to approximate a wide alveolar cleft or bony defectJ. J Plast Reconstr, 2000, 105(4):1262-1272.5 Eppley BL, Pietrzak WS, Blanton MW. Allograft and alloplastic bone substitutes: A review of science and technology for the craniomaxillofacial surgeonJ. J Craniofac Surg, 2005,16(6):981-989.6 Lee JA, Parrett BM, Conejero JA, et al. Biological alchemy: Engineering bone and fat from fatderived stem cellsJ. Ann Plast Surg,2003,50(6):610-617.7 Stefan L, Andreas