模拟微重力环境下层状修复体与软骨细胞复合培养的实验研究

1、模拟微重力环境下层状修复体与软骨细胞复合培养的实验研究         10-05-04 14:15:00     编辑：studa20            作者：张世浩，朱立新，靳安民，严乐平，王九现，黄锐，朱书涛 【摘要】  目的探讨模拟微重力作为软骨组织工程培养方法的作用和胶原/壳聚糖/-磷酸三钙（trical cium phosphate

2、，TCP）层状梯度修复体作为关节软骨组织工程支架的可行性。方法体外培养新西兰大白兔关节软骨细胞并扩增,吸附于多孔胶原/壳聚糖/-磷酸三钙层状梯度修复体上，模拟微重力和普通环境下三维立体分别培养3周,通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测微重力对软骨细胞培养的影响和支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。结果软骨细胞/修复体体外培养3周,软骨细胞模拟微重力培养组明显比普通培养组在层状修复体上分布均匀，修复体中心软骨细胞数量明显较多，并分泌细胞基质，包裹在软骨细胞周围，型胶原免疫组织化学染色阳性。结论模拟微重力环境有利于软骨细胞在三维支架上的均匀增殖，有望成

3、为软骨组织工程中的一种重要培养方法；胶原/壳聚糖/-磷酸三钙层状梯度修复体，细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料。 【关键词】  微重力; 层状修复体; 软骨细胞; 组织工程    Abstract：ObjectiveTo evaluate the feasibility of the minic microgravity as a method and the layered cylindric collagenchitosantricalcium phosphate composite as a scaffold for t

4、he cartilage tissue engineering after an observation of how it absorbs the chondrocytes and affects the cell behavior.MethodThe chondrocytes were isolated and multiplied in vitro,and then the chondrocytes were seeded onto the  porous collagenchitosantricalcium phosphate composite scaffold and w

5、ere cultured in both minic microgravity and ordinary environment for 3 weeks.The effects of the composite scaffold on the cell adhesivity,proliferation,morphological changes and synthesis of the extracellularmatrix were observed by the growth curve,phasecontrast microscopy,histology,scanning electro

6、n microscopy and immunohistochemistry.ResultThe chondrocytes that adhered to the scaffold increased significantly and secreted  extracellular matrix in the center of the porous scaffold around the chondrocytes under minic microgravity compared with ordinary environment.Immunohistochemistry of t

7、ype collagen was positive.ConclusionThe minic microgravity environment will be a good method for the cartilage tissue engineering.And the layered cylindric collagenchitosantricalcium  phosphate composite scaffold has a good cellular compatibility.It will be an ideal scaffold for the cartilage t

8、issue engineering.    Key words：microgravity；  layered composite；  chondrocyte；  tissue engineering    关节软骨损伤一直是骨科面临的难题之一。关节软骨本身缺乏营养血管，再生细胞和体液因子少，软骨的细胞/基质比低，一旦关节软骨损伤，其再生能力十分有限。此外，再生软骨的生物化学和机械性能不等同于正常软骨，容易退变和侵蚀。组织工程修复软骨手段的目的是将修复物质运送到受损部位并且固定于该位置以达到有效的修复 。从

9、研究结果来看，虽然研究者们应用了多种方法研究生物材料、种子细胞和修复，但修复关节软骨的长期效果并不令人满意，存在着组织工程软骨中心强度低、难以和宿主正常软骨整合、软骨和软骨下骨的断裂分层问题等难题13。作者希望通过最近新兴的模拟微重力技术，将软骨组织工程中应用广泛的胶原、壳聚糖与TCP有机复合,模仿体内关节软骨的分层结构,增加支架材料的力学强度，构建层状梯度复合材料，并将扩增的兔关节软骨细胞植入其中人工培养,观察软骨细胞在胶原/壳聚糖/-磷酸三钙层状梯度修复体中的黏附、增殖、生长情况及生物学性状变化,以评价微重力培养方法在软骨组织工程的实用性及该复合材料作为关节软骨组织工程支架的可行性。

10、60;   1  材料和方法     1.1  主要试剂和仪器    DMEM/F12、DHanks 、胰蛋白酶、EDTA (Sigma公司，美国)；型胶原酶(Gibco公司，美国)；胎牛血清（杭州四季青公司）；四氮唑蓝（上海思吉生物制品有限公司，中国）、型胶原抗体、S-100抗体、SABC试剂盒（武汉博士德公司）；12、24孔培养板（CorningCostar公司，美国）；旋转培养仪（Synthecon公司，美国）；离心机（Sigma公司，美国）；酶标测定仪（Metertech公司，台湾）；C

11、O2培养箱（Heraers Hera cell，德国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；胶原/壳聚糖/磷酸三钙层状梯度修复体由华南理工大学材料学院制作提供，直径5 mm，高5 mm圆柱形，上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/-磷酸三钙为主,两层之间逐渐过度，没有明显界限，平均孔径为100 m,孔隙率90%。    1.2  兔关节软骨细胞体外分离培养    1.3  修复体预处理    胶原/壳聚糖/-磷酸三钙层状梯度修复体经环氧乙烷消毒备用，实验前取12个置于12孔

12、培养板,DHanks洗3遍,每次20 min,再用DMEM/F12 液浸泡过夜。    1.4  细胞和支架复合普通培养    选择生长状态良好的第2、3 代细胞消化离心,用含10% 胎牛血清的DMEM/F12液配制成软骨细胞浓度为 1×107/ml,滴入经DMEM/F12液预湿的复合支架中,每个支架加入300 l，将培养板放入5%CO2浓度、饱和湿度、37培养箱内30 min，然后每孔加入1.0 ml DMEM/F12完全培养基继续培养。隔日换液,培养3周， 进行相关检测。    1

13、.5   细胞和支架复合模拟微重力培养    选择生长状态良好的第2、3 代软骨细胞消化离心,用含10% 胎牛血清的DMEM/F12液配制成软骨细胞浓度为 1×107/ml,滴入经DMEM/F12液预湿的复合支架中,每个支架加入300 l，置于孵箱中30 min后将细胞支架复合物放入微重力旋转培养仪中，加满DMEM/F12完全培养基，置于5%CO2浓度、饱和湿度、37培养箱内继续培养。隔日换液1/3,培养3周,进行相关检测。    1.5  检测指标    2

14、60; 结  果    2.1  软骨细胞形态    体外单层培养的软骨细胞刚接种时呈球形,悬浮在培养液中,24 h后开始贴壁,细胞呈扁平状,大多数为三角形，少量多角形,48 h后可见细胞分裂相,约1周后细胞铺满培养瓶瓶壁,折光度降低,呈“铺路石”样（图1）,可进行传代。第2、3代细胞S100免疫细胞化学染色胞浆内呈阳性反应（图2）。    2.2  生长曲线    软骨细胞和材料复合后，除第1 d两组之间无显著性差异外（P=0.857），其余6个时间点两组之间有显著性差异（P=0.007,0.002,0.001,0.000,0.000,0.000），微重力组均比培养板组增殖