柳枝稷生产燃料乙醇小试工艺研究

1、半纤维素预处理工艺与乙醇发酵研究摘要：在利用木质纤维素原料生产燃料乙醇的过程中，为了有效提高原料中半纤维素成分的利用率，节约生产成本，进行了稀硫酸预处理预处理小试工艺研究。本实验室利用自行设计定做的2L小型高温高压耐酸反应釜对柳枝稷稀硫酸预处理工艺条件进行了优化，最终确定在反应器可达到的范围内最优反应温度为140，最适稀硫酸浓度为2%，最适液固比为8：1。稀酸水解液中葡萄糖和木糖总浓度为35.3g/L,其中木糖24.7g/L,葡萄糖10.6g/L。利用本实验室菌种树干毕赤酵母Y7进行稀酸水解液乙醇发酵实验，84小时内木糖和葡萄糖被全部利用完，其中葡萄糖12小时用完，木糖84小时用完，最终乙醇浓

2、度为15.3g/L,占理论值产量的86.4%。本研究结果表明，稀酸水解可以有效提高木质纤维素原料中半纤维素成分的利用。 关键词：预处理；稀硫酸；水解液发酵；柳枝稷；树干毕赤酵母Y70引言目前，国内外利用木质纤维素原料生产燃料乙醇普遍采用的基本工艺流程是原料的预处理、预处理产物的酶解和乙醇发酵与蒸馏三步法。其中原料预处理方法的好坏对原料的中半纤维素利用、纤维素酶解效率和乙醇发酵效果具有直接影响。国内外报道的木质纤维原料预处理的方法主要有物理法，化学法，物理化学法，生物法等几大类。其中，稀酸水解预处理以其工艺简单、成本低、效率高等诸多优势被越来越广泛的研究和应用。木质纤维素的预处理主要通过一些物理

3、方法或者化学方法等对原料进行处理，使木质纤维素原料的整体结构更加松散，更加利于酶的接触与反应。同时，在预处理过程中木质素也被物理或化学等方法有效解离，使纤维素成分的保护结构被打破，更利于酶解反应的进行。但是这些预处理方法中存在一个越来越不能被忽视的问题就是原料中的半纤维素成分无法被回收利用。半纤维素是戊糖(木糖、阿拉伯糖)、己糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)和糖酸所组成的不均一聚糖，为异质多糖，结构与纤维素不同。木聚糖是含量最多的一类半纤维素1。半纤维素对温度，催化剂等的敏感性大于纤维素，在一定的物理或者化学等条件下比纤维素更加容易被水解。比如在蒸汽爆破预处理中，半纤维素在预处理过程中大量被水解成

4、木糖等可被微生物利用的糖，但这部分糖在预处理产物的水洗过程中混杂在水洗液中，很难被回收。在NaOH浸泡预处理中，半纤维素成分水解出的糖滞留在强碱性废液中，也很难被回收。 为了解决半纤维素回收利用中存在的问题，越来越多条件相对温和的预处理方法被广泛研究和利用，稀硫酸预处理就是其中最有代表性的方法之一。利用稀硫酸进行预处理可以有效的将半纤维素中的糖提取出来，而且稀硫酸预处理后的液体中含有的糖调过pH后可以直接被微生物利用。有研究报道在预处理的条件为100、水解6 h、固液比1：25，4稀硫酸条件下半纤维的提取率为51%。张宇昊等发现用稀酸预处理可将半纤维素有效转化为单糖，而剩余的纤维素成分可用纤维

5、素酶将其水解为小分子糖。 利用玉米秸秆在15%固体含量、0.5%的H2S04浓度、121、1 h条件下，先将半纤维素进行水解，然后用酶解法提取预处理产物中的小分子糖，糖回收率可以达到85%。本研究以能源草柳枝稷为原料，在反应釜中利用稀硫酸高温蒸煮的方法提取木质纤维素原料中半纤维素成分中的可利用糖，旨在建立一种可以简单高效利用半纤维素的方法。通过实验对反应温度、稀硫酸浓度、固液比三个因素对半纤维素水解的影响进行了分析，寻找最佳的工艺参数，并利用本实验室的乙醇发酵菌种树干毕赤酵母Y7对水解液进行乙醇发酵实验，研究水解产物利用的可行性。实验证明，改方法可以有效回收和利用木质纤维素原料中的半纤维素成分

6、，提高原料的利用率。1 材料与方法11 菌种树干毕赤酵母Y7（Pichia. stipitis Y7）由首都师范大学微生物学系保藏，该菌种能够同时代谢木糖和葡萄糖，并且具有高抑制剂耐受性。12 原料粉碎柳枝稷样品由北京市农业科学院草业研究中心提供，样品含纤维素30%，半纤维素25.5%，其他45.5%。自然晾干后，利用小型粉碎机粉碎，过30目筛。13 木质纤维素稀酸水解131 反应釜本实验反应器是从威海新元化工机械公司定制的耐酸高温高压反应釜，最大装量2L，最高反应温150，最高搅拌速率6000rpm。132 装量反应釜最大装量为2L。本批实验中，每次实验装入液体1.5L，固体量按照实验设定的

7、液固比添加。133 反应条件温度梯度：110；120；130；140。硫酸浓度梯度：1%（v/v）；2%；3%；4%；5%。固液比梯度：1：2（w/v）；1：4；1：6；1：8；1：10；1：12；1：14。反应时间：60min。14 水解液处理与培养基配制稀酸水解液用NaOH固体调价pH值至中性，然后加入2%（w/v）蛋白胨和1%（w/v）酵母浸粉。在高压蒸汽灭菌锅内115灭菌30min。15 乙醇发酵151 接种物制备将斜面保藏的菌种接种于100ml培养基中，30 、150rpm树干毕赤酵母Y7培养12h。在不同三角瓶中转接三次。种子液细胞干重为3.0g/L。接种时1000rmp离心10m

8、in取菌泥，接种量为10%。152 发酵条件控制在额定装量2L的小型发酵罐上进行发酵实验。发酵温度30 ，pH值控制在4.5-5.5，搅拌转速为300rpm，装量1.5L。定时取样，测定测定乙醇产量和残糖量。16 分析方法161 糖浓度测定样品经0.12m微型过滤器过滤,用高效液相色谱仪(Highliquid chromatography HPLC，Waters 2690)测定样品中葡萄糖和木糖的含量。测定条件：氨柱(200 ×46mm)，柱温40，waters410视差测器，流动相已腈：水=85：15，进样量20L.162 乙醇含量测定样品经0.12m微型过滤器过滤,用SP-342

9、0 气相色谱测定乙醇含量。测定条件:柱温80 ,注射室温度150 ,检测器温度50 ,进样量0.5L 。17计算方法高效液相色谱和气相色谱的计算方法均采用样品峰面积与标准峰面积相比较获得。 乙醇含量的计算方法:X = ( S1 ×C)/S2 ×100 %式中, X 样品中乙醇含量, g/L ; S1 样品峰面积; C 标准溶液浓度g/L; S2 标准溶液峰面积。乙醇生成率计算公式:X = C1/( C2 ×0.51) ×100 %式中, X 乙醇生成率; C1 测得的乙醇含量;C2 消耗糖的量g/L2 结果与讨论21 硫酸浓度对水解液中糖浓度的影响在14

10、0，固液比为1：8的条件下研究了硫酸浓度对水解液中木糖和葡萄糖浓度的影响。从图1中可以看出，木糖浓度在1%硫酸浓度时最高，最高糖浓度为25.6g/L，并随着硫酸浓度的升高呈现下降趋势。葡萄糖浓度随硫酸浓度的增加呈上升趋势，在5%硫酸浓度时达到最大为11.9 g/L。随着酸浓度的增加木糖浓度下降，主要原因是由于硫酸浓度的增加导致了木糖的氧化分解加剧。而葡萄糖浓度之所以升高则是由于随着酸浓度的增加木质纤维素中的纤维素水解程度增加，所以水解液中葡萄糖的含量升高。所以根据经济性和回收率的综合考虑，最适酸浓度为2%。图1 硫酸浓度对水解液中糖含量的影响Fig1 Glucose fermentation

11、of Y5？22 反应温度对水解液中糖浓度的影响从图2中可以随着温度的升高，水解液中的木糖浓度逐渐上升。在2%硫酸浓度条件下，木糖浓度在140达到最高为24.7g/L。通过2%与3%硫酸浓度比较发现，二者最终的木糖量相差不大，这表明在2%硫酸浓度下，原料中的半纤维素成分已经得到比较充分的水解，所以不再随硫酸浓度的增加而增加。从图3可以看出，随着温度的升高，水解液中葡萄糖浓度逐渐上升，在2%硫酸浓度条件下，葡萄糖浓度在140为10.6g/L。葡萄糖浓度在2%与3%硫酸浓度条件下依然相差不大。从以上结果可以看出，在反应釜可以达到的温度范围内，最适反应温度为140。图2 温度对水解液中木糖含量的影响

12、图3 温度对水解液中葡萄糖含量的影响23 固液比对水解液中糖浓度的影响图4显示的是，随着固液比的提高，水解液中木糖和葡萄糖糖浓度的变化规律。随着固液比的提高，稀酸水解液中木糖的浓度呈上升趋势。在固液比为1：4时木糖浓度达到最高为26.2g/L。随着固液比的提高，葡萄糖的浓度呈下降趋势，即当反应体系中的含水量减少，水解液中葡萄糖的浓度随之降低。实验发现，反应体系中液体的绝对量越大，水解出的糖的总量就越高。图5显示了，以1：14固液比时水解液中糖的质量为基准，各固液比反应体系中水解出糖量的相对值。在固液比为1：12、1：10、1：8、1：6、1：4时，水解出的木糖总质量分别是固液比1：14时水解液

13、中木糖总质量的97.50%、94.80%、93.72%、72.40%、49.60%，水解出的葡萄糖的总质量分别是固液比1：14时水解液中葡萄糖总质量的92.16%、70.33%、67.05%、55.81%、20.90%。因此，兼顾经济性和总体回收率的考虑，反应体系的最适的固液比为1：8。从以上实验结果可以看出，木糖和葡萄糖在稀酸水解的过程中对水都有一定的依赖性，而且葡萄糖水解对水的依赖性大于木糖，理论上来讲，反应体系中的液体量越大，对糖的水解反应越有利。但是，如果固液比过低，会造成反应体系运行效率低，也会造成后续工艺成本的大幅度提高。图4 固液比对水解液中糖浓度的影响图5 不同固液比中糖回收率（以固液比1：14时糖量为基准）24 未