AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程

1、颁发部门制订人：复核人：批准人：质保部制订日期：复核日期：批准日其1：执行日期版本1.0号SOP04006制作份数蛔修订记录份肄修订人发送部门英修订原因量修订内容聿版本莅修订日期.1 .螂目的:辐确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。2 .3 .腿范围：蟆适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。4 .5 .蒙定义：腿无.6 .腿职责：滕荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。羁质保部对本规定的有效执行承担监督检查责任。7 .8 .凌内容：芳5.1室内温度控制在1530C,相对湿度4575%。范5.2仪器操作董5.2.1依次打开电脑显示器和电脑主

2、机的电源开关，进入Windows界面。芨5.2.2接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。箴5.2.3点击7500Softwarev2.3图标，打开软件。妨5.2.4按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测的8联PCR反应管或者96孔PCR反应板放入检测孔位，记下放置位置。检测8联PCR反应管用*反应孔模块，检测96孔PCR反应板用*反应孔模块。（检测8联PCR反应管需放入盖紧管盖的空8联PCR反应管配平，检测96孔PCR反应板无需配平）赚5.2.5再次按压托盘使其滑入仪器。筮5.2.6新建扩增参数模板：例如新建一个UG-63-62的模板，扩增参数是95°,10-（9

3、5°,10"63°,45）X5cycles;（95°,10；62°,35）X40cycles,在62°时收集荧光信号（HEX、FAM信号），201反应体系。盾5.2.6.1在Setup-PlateSetup-DefineTargetsandSamples中，将TargetName下的Target1改成FAM;点击AddNewTarget,将新增的Target1改成HEX,点击Reportee下拉菜单，选择VIC。b5.2.6.2在Setup-RunMethod-GraphicalView中的ReactionVolumePerWell后

4、面输入20（201反应体系）。选中第一个HoldingStage,点击DeleteSelected删除；在CyclingStage中的NumberofCycles后输入5,在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度63度，输入时间45秒，将63度下面收集荧光图标点掉；点击AddStage下拉菜单选择Cycling,在CyclingStage中的NumberofCycles后输入40,在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度62度，输入时间35秒，在62度下面点击图标收集荧光。亵3点击Save下拉菜单下的SaveAsTamplate,文件名输入UG-63-62,保存在默认a

5、b7500-config-tamplates文件夹内，关闭设置界面。膀5.2.7已有扩增参数模板：在软件Home界面中点击Template,选择需要的模板，点击打开。例如：UG-63-62,其扩增参数就是95°,10'（95°,10"63°,45"）X5cycles;（95°,10"62°,35"）>40cycles,在62°时收集荧光信号（HEX、FAM信号）,ReactionVolumePerWell:20口（20口反应体系）。#5.2.8在Setup-PlateSetup-A

6、ssignTargetsandSamples中选择8联管摆放的位置，全部勾选Sample1;UGT1A1*6勾选HEX,UGT1A1*28勾选FAM。荽5.2.9在Run-AmplificationPlot中点击STARTRUN,命名为（当日日期+当日上机次数，例:2014年1月1日第1次上机编号为），保存在默认文件夹中，开始运行。范结果分析衿PCR反应结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析。斯也可根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在315、End值可设在520）,Threshold值（Rn）推荐设定为500015000，

7、点击Analyze进行分析，然后到Plate窗口下记录每个反应的Ct值。董实验结束后取出反应管（切勿打开管盖），顺序关闭AB7500软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。蠢5.3仪器维护妍5.3.1每周维护研检查计算机磁盘空间。如需要，将实验文件归档或备份。肄？至少每周检查一次计算机磁盘空间。蓬?如果硬盘的可用空间不足其总容量的20%,应将较陈旧的数据传输到备份存储设备上保存。嫌用无绒布块（不脱毛）蘸取75%酒精清洁7500Instrument的表面。（注：切勿使用有机溶剂清洁7500Instrument。）菜使用75%酒精浸泡反应管托架（晾干后放回仪器内）膂5.3.2每月维护蔓执行背景校准。（可

8、执行一次背景校准以检查是否存在污染物）袈运行磁盘清理和磁盘碎片整理。袅？至少每月一次。蚀？当Windows?操作系统显示消息提示执行碎片整理时。芈？切勿同时运行磁盘管理实用工具和7500Real-TimePCRSoftware。«5.3.3每半年（6个月）维护黄1检查灯具状态。前在7500Software中，选择InstrumentfLampStatus/Replacement以确定卤素灯的状态。范显示LampStatus/Replacement对话框:肇?Condition-表示以下其中一种状况:希-Good-灯具工作良好，不需要更换。单击Close。肄-Failed-必须更换灯具

9、。单击Close,然后按照步骤更换卤素灯。聿-ChangeSoon-灯具使用超过2000小时；生产商建议将其更换。单击Close,然后决定是否更换灯具。如果决定更换，请按照步骤更换卤素灯。腿？Usage（Hours）-灯具已照明的总小时数。蝴？LampCurrent-灯具的输出电流，以安培为单位（A）。低电流意味着灯具可能将要失效。蔽?DateLastReplaced-上次更换灯具的日期。蝇在执行一次运行之前或期间，7500Software可能显示以下警告:芾消息瞩描述充Warning-CannotdetectsufficientcurrentIF在运行开始时，灯具电流低于可接受水平。from

10、lamp.Eitherlampisnotinstalledproperly在按照步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运orneedstobereplaced.行。芾Warning-Cannotdetectsufficientcurrent菱7500Software停止了该次运行，因为在运fromlamp.Eitherlampisnotinstalledproperly行中灯具电流下降到可接受水平之下。在按照orneedstobereplaced.步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运行。在消息框中单击OK,检查仪器日志，然后更换灯具。蚂Warning-Thelampusagehasexceeded20

11、00奥在运行开始时，灯具使用时间超过2000小hr.Werecommendreplacingthelampsoonto时。单击CancelRun,然后更换灯具，或者ensureoptimalassayperformance.单击ContinueRun。重新运行ROI、背景、光学和染料校准。勘执行目标区（ROI）校正。生执行背景校准。,执行光学校准。蔗执行染料校准。藏执彳RRNaseP仪器验证试验。肄5.3.4其它维护任务（需要时执行）袁样本块污染清除。腿执行以下程序，去除7500Instrument样本块的荧光污染。荧光污染是导致背景运行失败的常见原因，在此情况下，一个或多个反应孔会持续表现出

12、异常的高信号。薇注意！切勿移去设备上的盖板。7500Instrument中没有用户可安全维修的组件。如果怀疑存在问题，请联系生产商服务代表。蔻全程戴上一次性无粉手套操作。蒲找到样本块中受污染的反应孔（参阅“如何确定污染”）。赚从7500Real-TimePCRInstrument中取出反应板和托盘支架。蜗a.按压托盘门，将其打开。袅b.取出反应板和托盘支架。屋c.关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。雷手动降低样本块：黄b.在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中,单击StartManualCalibration螃c.在ROIInspector对话框中，单

13、击MoveBlock。蝇d.当ROIInspector对话框显示“BlockDown”时，单击Done。祎关闭7500Real-TimePCRInstrument,然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。蒙打开7500Real-TimePCRInstrument的检查门。赚a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。曹b.打开仪器前门。祎抬起门栓，然后将受热的护盖门推到仪器的背面。袄使用少量的双蒸水，清洁样本块中被污染的反应孔：蠢a.用移液管吸取少量双蒸水并滴入每个受污染的反应孔中。奠b.抽吸并滴入反应孔中的双蒸水数次，以冲洗反应孔。噩c.将用过的双蒸水水吸入废液瓶中。芍

14、d.使用棉花拭子，擦试每个被污染的反应孔的内壁。筮e.使用无绒布料，吸出残余的双蒸水。芳7500Real-TimePCRInstrument将受热的护盖门拉到仪器的正面。抬起门栓，然后将受热的护盖门紧固到交叉杆。期？插上电源插头并开启7500Instrument。肃?通过执行背景校准运行确认已消除污染（参阅5.4.2“背景校准”）。聿？如果污染仍然存在，重复步骤至，然后使用95%乙醇溶液清洁样本块中受污染的反应孔：滕a.用移液管吸取少量95%乙醇溶液并滴入每个受污染的反应孔中。肇b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。薄c.将用过的乙醇溶液吸入废液瓶中。建重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液

15、清洁反应孔之后，应始终使用双蒸水冲洗反应孔。觉?重复步骤至？，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。膈?如果污染仍然存在，重复步骤至，然后使用10%漂白剂溶液清洁样本块中受污染的反应孔：节a.用移液管吸取少量10%漂白剂溶液并滴入每个受污染的反应孔中。神b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。莆c.将用过的漂白剂溶液吸入废液瓶中。勘重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用去离子水冲洗反应孔。蟆？重复步骤至？，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。如果仍有污染，请与生产商技术支持联系。蓬？确保受热盖门完全关闭并上闩。如果没有，则7500Software显示错误

16、消息。芈2移动PCR仪。（更换或移动光学器件的任何部件后，必须执行ROI校准、背景校准、光学校准、染料校准以及RNaseP仪器验证。）蟆3更换卤素灯。充全程戴上一次性无粉手套操作。膀关闭7500Instrument,然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。芈a.注意！灼热。7500Instrument和灯具灼热！灯具在使用中会变得非常灼热。在处理灯具之前，应允许灯具冷却15分钟，并戴上无粉防护手套。膈b.重要！为避免灼伤及缩短新灯具的使用寿命，处理灯具时请戴上一次性无粉手套。噩c.注意！7500Instrument按设计仅可使用12V、75W的卤素灯。荒打开7500Instrument的检查

17、门。芨a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。莅b.打开仪器前门。黄从仪器中取出灯具：辐a.向下滑动灯具释放杆。藏b.用手紧紧地抓住卤素灯并向上提，使灯具从安装槽口中脱出。滕查看灯具并确定有无故障迹象（有故障的灯具内壁上通常有碳黑层）腿将新灯具安装至仪器上：袁a.向上滑动灯具释放杆。腿b.用手紧紧地握住灯具，将灯具放入带槽口的安装座内，然后小心地向下滑动灯具，使其到位。薄关闭仪器前门。端插上电源插头并开启7500Instrument。袁打开ROIInspector对话框：#a.在7500Software中，选择InstrumentfInstrumentMaintenan

18、ceManager。黄b.在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartManualCalibration。蒲在ROIInspector对话框中，选择LampControl一Idle。羁？当仪器运行时，通过检查门上的缝隙观察，确保灯具发光，然后单击Done。量?如果灯具发光，在7500Software中选择InstrumentLampStatus/Replacement,单击ResetLampTimer,然后单击OK。如果灯具不发光，则替换的卤素灯可能有缺陷。重新更换灯具。如果再次更换灯具后仍不发光，检查仪器的保险丝是否存在故障（参阅第71页）。螃？

19、更换灯具后，按顺序执行以下校准。请参阅：前？5.4.1目标区（ROI）校准序?5.4.2背景校准肆?5.4.3光学校准菜?5.4.4染料校准聿？5.4.5验证仪器性能赚4更换7500Instrument保险丝。荽保险丝损坏时，更换7500Real-TimePCRInstrument保险丝。（注意！为在长时间内防止火灾，更换保险丝时请使用类型和额定值与仪器原始保险丝相同的经认可的保险丝。）暮全程戴上一次性无粉手套操作。膈关闭仪器电源，并拔下电源插头。荒使用平口螺丝刀从仪器上旋松并卸下保险丝座。神将每一个保险丝从其保险丝座中取出，然后检查是否损坏。损坏的保险丝内部通常有炭黑覆盖。蛔使用12.5A、

20、250V、5X20mm保险丝更换损坏的保险丝。辐注：电压和电流额定值见保险丝座。筮安装保险丝座。芈插上电源插头，然后开启仪器。如果仪器接通了电源，说明保险丝已安装成功。肃注：保险丝损坏可能是由仪器供电电源波动导致。为了防止继续出现故障，可以考虑安装电气保护设备，例如UPS或其他电涌保护器。蚁5更新Windows盆更新7500Software。莅7监控仪器状态（使用FunctionTest对话框又主要7500Instrument组件执行高级诊断。一般情况下不需要执行功能测试，除非怀疑有硬件故障，或者LifeTechnologies代表指示这样做。）嵋在7500Software中，选择Instru

21、mentfFunction-Test。盆根据需要执行功能测试。要测试：盆所有组件-单击AllTests,然后等候软件执行所有功能测试。蟆一个或多个特定组件-单击以下其中一项或多项。荒？USB-测试7500Real-TimePCRInstrument和计算机之间的通用串行总线（USB）连接。如果7500Software能够和7500Real-TimePCRInstrument建立通信，则表示测试通过。募?CCD-测试7500Real-TimePCRInstrument内的CCD摄像机。如果摄像机能够拍摄图像，则表示测试通过。薄?FilterWheel-测试7500Real-TimePCRInst

22、rument内的过滤轮。如果过滤轮控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。芾？Shutter-测试7500Real-TimePCRInstrument的光学快门。如果快门控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。腿?Lamp-测试7500Real-TimePCRInstrument的卤素灯。如果灯具控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。«?ThermalCycler-测试7500Real-TimePCRInstrument内的热循环仪样本块。如果热循环仪的控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。荽当7500Software完成一项测试时，软件报告该测试的通过/失败状态，并提供

23、结果描述。黄结束测试时，单击Close。膈5.4仪器校准蟆5.4.1目标区（ROI）校准荽5.4.1.1全程戴上一次性无粉手套操作。刷5.4.1.2从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反应板。神5.4.1.3让ROI校准反应板温度上升至室内温度（约需5分钟）。在立即运行反应板之前，不要从包装袋内取出ROI校准反应板。反应孔中的荧光染料具有光敏感特性。长时间曝光可降低染料在反应板中的荧光。蝇5.4.1.4从包装袋中取出ROI校准反应板。将光学薄膜留在反应板上。不要丢弃存放ROI校准反应板的包装袋。若贮存于原始包袋中，反应板最多可重复使用三次。«5.4.1.5振荡ROI校准反应

24、板5秒钟。袁5.4.1.6用板式离心机将反应板离心2分钟。ROI校准反应板必须充分混合并离心。蔽5.4.1.7确认ROI校准反应板每个反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更高的转速及更长的时间离心反应板。#5.4.1.8按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正确对齐。（装入标准反应板，使A12凹口位置位于托盘的右上角。）期5.4.1.9以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。节5.4.1.10执行自动ROI校准聿在7500Software中，选择InstrumentfInstrumentMaintenanceManager前在I

25、nstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartCalibration。嵋按照向导的指示，完成校准。ROICalibration对话框显示三个选项卡:董？Setup-显示ROI校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。螂？Run-单击STARTRUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开Analysis选项卡。肆？Analysis-指明校准状态（Passed/Failed）。袅如果校准失败，请参阅“排除ROI校准故障”。肄5.4.1.11执行手动ROI校准方在7500Software中，选择InstrumentfInstrume

26、ntMaintenanceManager腿在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartManualCalibration。箍在ROIInspector对话框中（如图1）:范a.在ExposureTime字段中，输入2048。辐b.选择FilterA（滤光器1）。袈图1箍单击Snapshot,生成一张ROI图像。蚂确定ROI图像是否可接受（下图所示为未饱和以及过饱和的图像）。可接受图像中的反应孔：展?在不过饱和的前提下，必须尽可能明亮。（生成ROI校准时，如果反应孔过饱和，则显示一条警告。）生?可以含有但不是必须含有红色像素（表示饱和）索未饱和肃正常

27、饱和赚过度饱和蚀可接受m/、可接受蒙如果ROI图像可接受，转至步骤。如果ROI图像过饱和，将ExposureTime降低一半，然后单击Snapshot。重复执行，直至获得可接受的ROI图像。如果无法获得可接受的图像，请参阅“排除ROI校准故障”。凌单击GenerateCalibration。7500Software采集一张截图，然后显示一个消息框或ROI图像：曹如果软件显示：芍执行：袄或范a.单击OK。芾b.将ExposureTime降低一半（参阅5.4.1.11步骤a）o莅c.重复步骤和。羁ROI图像非常模糊或者无法成功校准。奠请参阅“排除ROI校准故障”。袈可接受的校准图像司验证以下各项：

28、芾注：在所有反应孔周围出现绿色圆圈，表示反应孔成功校准。一|袁?WellsFound值为96。艘注：绿色圆圈表示反应孔位置的目标区已足够亮。勘成功校准-WellsFound必须为96。薄?在ROI图像上每个反应孔区的周围显示绿色圆圈。J单击SaveCalibration。蚀软件保存滤光器1新产生的ROI校准。在ROIInspector的FilterMasksLoaded区域，“OK”ExposureTime重置为ExposureTime重置为出现在滤光器1旁边。对其余滤光器重复步骤至，对每个滤光器执行校准之前，将2048。当所有滤光器的FilterMasksLoaded都显示OK时，ROI校准

29、完成。当所有滤光器的FilterMasksLoaded都是OK时，校准完成。点击Done。技拆卸反应板（注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100°Co若刚使用过仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。）荽取出校准反应板：勘a.按压托盘门，将其打开。袁b.取出校准反应板。蒂c.按压托盘门，将其关闭。菱将校准反应板放入其包装套中。如果要执行背景和光学校准：薄a.在接下来的8小时，将ROI校准反应板置于室温下。光学校准使用ROI校准反应板。蒲b.第二天将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。赚c.重要！不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，

30、在打开其包装后最多可重复使用反应板3次。蜗d.重要！执行ROI校准后，也必须执行背景校准、光学校准、染料校准以及仪器验证。箍排除ROI校准故障莅问题/症状辑可能原因爆行动莆ROI校准失败螂样本块可能位于崛1.如果ROIInspector的CCDControl/Settings显示“Block降低的位置。Up”，则单击BlockUp将样本块升高。劳ROI图像模糊祎2.检查确认受热的盖组件已被全程向前拉出，以确保托盘可1以被正确推入。如果7500Instrument安装了受热盖栓，检查确认盖栓处于锁定位置。蒂3.如果ROI校准仍然失败，检查7500Instrument内的卤素灯状态（参阅“监控灯具

31、状态”），然后，如果需要时，更换灯具（参阅“更换卤素灯”）。藏5.4.2背景校准蚂全程戴上一次性无粉手套操作。覆从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出准备好的背景反应板。妍让背景反应板温度上升至室温（至少需要5分钟）。黄从包装袋中取出背景反应板。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。若将背景反应板贮存在其原始包装套内，背景反应板最多可重复使用三次。）腿振荡反应板5秒钟。辑用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认反应板每个背景反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。蔗按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器

32、中被正确对齐。以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。（注：如果无法打开托盘，样本块可能位于其“升高”位置，锁定了托盘门位置。要降低样本块，选择Instrument-Calibrate,然后退出ROIInspector。）索在7500Software中，选择InstrumentfInstrumentMaintenanceManager。在InstrumentMaintenanceManager中，选择Background选项卡。在Background选项卡中，单击StartCalibration。索按照向导的指示，完成校准。BackgroundCalibration对话框显示四个选项卡:

33、筮?Overview-显示校准相关信息。袈？Setup-显示背景校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。肇？Run-单击STARTRUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开Analysis选项卡。瞧?Analysis-指明校准状态（Passed/Failed）。螂如果校准失败，请参阅“排除背景校准故障”。薄注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。行校准完成后，取出校准反应板：芍按压托盘门，将其打开。膈取出校准反应板。肇按压托盘门，使其滑入仪器。菱将校准反应板放入其包装套内，并将包装好的反应板放回冷冻柜内的光谱校准

34、套件中。（重要！不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在初次打开其包装后最多可重复使用反应板3次。）莅排除背景校准故障展问题/症状蝇可能原因莅行动菜背景校准失败蜜背景反应板上的一个或|腿1.使用相同的背景反应板重复执行校准。多个反应孔产生的光谱超1过仪器的最高限度。|苗2.若校准再次失败，请使用另一不同的背景反应板重复执行校准。薄3.若校准再次失败，请按下文“如何确定污染”的说明，确定污染源。肄如何确定污染蚁若信号超过正常背景荧光的限度，则表明校准反应板或样本块上存在荧光污染物。常见污染物包括记号笔中残存的油墨、一次性手套洒落的粉末及灰尘。欲确定污染来源和位置：勘在查看原始数

35、据时，选择反应板布局中数块连续的较小区域，以找出受污染反应孔英的位置。腿将背景反应板旋转180。，然后再次执行背景校准。蟆重复步骤以找出污染物的位置。如果步骤和中找到的包含污染物的反应孔位置：藏？相同-则表明样本块中含有污染物。请按照“样本块污染清除”的说明，除去样本块中的污染物。蓬?相反-则表明背景反应板中含有污染物。丢弃当前使用的背景反应板，并使用新背景反应板执行背景校准程序。袁如果更换背景反应板并且取出样本块的污染后校准失败:菱将用黑纸覆盖的反应板装入7500Instrument薇按照本章的说明，执行背景校准程序。袂校准完成后，选择反应板布局中的所有反应孔。放查看光谱图谱中的峰值。如果峰

36、值：覆?可见-则表明7500Instrument的光学部件可能已被污染。请与生产商联系。期？不存在-则表明样本块已被污染。请按照“样本块污染清除”的说明，除去样本块中的污染物。用5.4.3光学校准屋全程戴上一次性无粉手套操作。芨从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反应板。蟆让ROI校准反应板温度上升至室温（至少需要5分钟）。妨从包装袋中取出ROI校准反应板，振荡反应板5秒钟。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。若将ROI校准反应板贮存在其原始包装套内，ROI校准反应板最多可重复使用三次。）唐（如果执行ROI校准后，将ROI校准反应板保持在室温，则跳到步骤，以减少在反应板在室温时形成的

37、冷凝。如果ROI校准反应板位于冷冻柜中，转至步骤。肇用板式离心机将反应板离心2分钟。ROI校准反应板必须充分混合并离心。确认ROI校准反应板每个反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。祎按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正确对齐。以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。索在7500Software中，选择InstrumentfInstrumentMaintenanceManager。在InstrumentMaintenanceManager中，选择Optical选项卡。在Optical选项卡中，单击Star

38、tCalibration。赚按照向导的指示，完成校准。OpticalCalibration对话框显示四个选项卡：月堇2Overview-显示校准相关信息。未?Setup-显示光学校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。节？Run-单击STARTRUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开Analysis选项卡。幕?Analysis-指明校准状态（Passed/Failed）。衿如果校准失败，请参阅“排除背景校准故障”。墨注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。章取出校准反应板：滕按压托盘门，将其打开。蒂取出校准反应

39、板。袂按压托盘门，使其滑入仪器。蝇将校准反应板放入其包装套中。将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。（重要!不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在打开其包装后最多可重复使用反应板3次。）袈5.4.4染料校准膂全程戴上一次性无粉手套操作。袂从冷冻柜中取出光谱校准套件，并从套件内取出所有染料反应板。膀将光谱校准套件放回冷冻柜贮藏。黄让染料反应板温度上升至室内温度（约需5分钟）。瞧（重要！在立即运行之前，请勿从包装袋内取出染料反应板。在每个染料反应板上，反应孔中的荧光染料具有光敏感特性。长时间暴露在光线中会降低反应板的荧光信号强度。）羁注：如果将7500Real

40、-TimePCRInstrument染料反应板贮存在其原始包装内并放在冷冻柜中，则在打开包装后6个月内可以校准7500Real-TimePCRInstrument最多3次。袄在7500Software中，选择InstrumentfInstrumentMaintenanceManager。在InstrumentMaintenanceManager中，选择Dye选项卡。在Dye屏幕上，选择SystemDyeCalibration。单击StartCalibration。薄按照向导的指示，完成每个反应板的校准。（重要！在每个校准中，向导将单独指示。必须独立设置、运行和分析每个染料反应板。）DyeCal

41、ibration对话框显示四个选项卡：奥？Overview-显示校准相关信息。当软件提示获取需要的材料时，选择要校准的染料。第？Setup-显示染料校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。当软件提示装入染料反应板时，按照步骤所述准备并装载反应板。弋?Run-单击STARTRUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开Analysis选项卡。蠢?Analysis-指明校准状态（Passed/Failed）。当软件提示分析从每个染料反应板采集的光谱时，核实校准的状态：方?Passed7500Instrument校准通过。转到步骤11的。斯?Failed-7500Inst

42、rument校准失败。请参阅“排除染料校准故障”。期注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。嵋将软件所需的染料反应板从其包装中取出。振荡反应板5秒钟。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。若贮存于原包袋中，反应板最多可重复使用3次。常用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认反应板每个背景反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。崛检查并确保要装入的染料反应板与在7500Software中选取的荧光匹配。肇按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正确对齐

43、。关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。（注：如果无法打开托盘，样本块可能位于其“升高”位置，锁定了托盘位置。要降低样本块，选择InstrumentCalibrate,然后退出ROIInspector。）膈因为向导对每个染料校准单独提供指示，所以请对校准的每个染料执行以下程序。0Hbl1曲Han袈曹袅b建区踊验证校准状态:薄?Passed7500Instrument校准通过。转至Ub）。前？Failed7500Instrument校准失败。请参阅“排除染料校准故障”莅核实染料光谱的分组:蝴a.在反应板布局中，选择反应板的孔。腿b.检查原始数据。对于每个光谱，请确认峰值:蜜？位于7500In

44、strument的可检测范围内。芨?无不规格光谱峰值。袄?出现在染料的正确通道上。膂如果某光谱不符合上述标准，请参阅“排除染料校准故障”芈注：在含有相同染料的各反应孔中，光谱位置和峰值位置的差异是由于不同反应孔之间的光学属性及激发能存在细微差异而引起的。腿若所有光谱均可接受，则单击Next。肄取出校准反应板：（注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100°Co若刚使用过仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。）着按压托盘门，将其打开。辑取出校准反应板。噩按压托盘门，将其关闭。肃将校准反应板放入其包装套中。将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。（注：如果将

45、7500Real-TimePCRInstrument染料反应板贮存在其原始包装内并放在冷冻柜中，则在打开包装后6个月内可以校准7500Real-TimePCRInstrument最多3次。）肄在按照指示将染料反应板取出后，单击Finish。曹按照开始操作，准备并运行下一个反应板。量滤为口口服峰值（nm）星染料/光谱膀1嫄-520FAM染料SYBRGreen染料蒂2妨-550其JOE染料VIC染料33蚯-580CY3染料NED染料TAMRA染料排除染料校准故障4-610ROX染料TEXASRED染料5-670CY5染料问题/症状可能原因行动一个或多个原始光谱达到或低于校准的可检测阈值。J?光谱校

46、准反应板未充分离o?光谱校准反应板含有陈旧试1.卸载7500Instrument并查看光谱校准反应板的反应孔。若反应孔中的液体不是：-位于反应孔底部，请将反应板离心更长时间，剂或试剂体积不足。然后重复执行校准。?若止运行定制光谱校准反应-体积相等，则表明反应板未密封致使试剂挥板，染料可能浓度小足。悭。请将其丢弃，并运行另一反应板。J2.若光谱校准反应板显示正常，则丢弃该反应板并运行另一块反应板。3.如果问题依然存在，请与生产商联系。注：若止运行定制光谱校准反应板，请创建另一反应板但要增加产生不足信号的染料的浓度。个或多个原始光|?样本块或光谱校准反应板含请按照5.4.2“背景校准”操作，以确认

47、是否存在谱超过7500有荧光污染物。污染物。若背景校准未显示样本块含有污染物，则Instrument的最高?若止运行定制光谱校准反应光谱校准反应板可能含有污染物。限量。板，染料可能浓度过大。注：若止运行定制光谱校准反应板，请创建另一反光谱在一个以上的卜羊本块或光谱校准反应板含应板但要降低超过可检测限量的染料的浓度。滤光器中含有峰有荧光污染物。值。5.4.5验证仪器性能全程戴上一次性无粉手套操作。冷冻柜中取出TaqMan?RNaseP96-WellInstrumentVerificationPlate,然后让反应板温度上升到室温（大约需要5分钟）。从包装袋中取出RNaseP反应板。振荡反应板5秒

48、钟。用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认液体位于反应板每个反应孔底部。如果不是，则再次以更长的时间离心反应板。（重要！注意不要让RNaseP反应板的底部染上尘污。反应板底部沾上的液体和其它污染物可污染样品区组，导致异常高的背景信号。）上图为RNaseP反应板上标准和未知种群的分布情况。RNaseP反应板包括五个重复组的标准物（1250、2500、5000、10,000和20,000拷贝）、两个未知重复组（5000和10,000拷贝）和阴性对照反应孔（NC）。按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正确对齐。关闭托盘门。以

49、一定角度向托盘右侧施加压力。开始运行反应板：在7500Software中，选择InstrumentfInstrumentMaintenanceManager。在InstrumentMaintenanceManager中，选择RNaseP选项卡。在RNaseP屏幕，单击StartRNasePRun。按照向导的指示，完成校准。RNaseP对话框显示四个选项卡:?Overview-显示校准相关信息。?Setup-显示RNaseP运行设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。?Run-单击STARTRUN可以开始运行流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开Analysis选项卡。?Analysis-指明运行状态（Passed/Failed）。注：开始运行之前，仪器可能暂停（最长10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。注：7500Software完成RNaseP运行后，会自动分析运行，并在Analysis屏幕显示结果。在RNasePRun向导的Analys