分子生物学教案

1、中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教 案第五章 基因表达的调控概 述一、基因表达的概念基因(gene)：负载特定遗传信息的DNA片段，其结构包括编码序列、非编码调节序列和内含子组成的DNA区域。基因组(genome)：一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因。基因表达(gene expression)：是指原核生物和真核生物基因组中特定的结构基因所携带的遗传信息，经过转录、翻译等一系列过程，合成具有特定的生物学功能的各种蛋白质，表现出特定的生物学效应的全过程。基因表达的调控：在同一机体的各种细胞中虽然含有相同的遗传信息即相同的结构基因，但并非它们都在所有细胞中同时表达，而必须根据

2、机体的不同发育阶段、不同的组织细胞及不同的功能状态，选择性、程序性地表达特定数量的特定基因，这就是基因表达的调控。基因表达调控水平：基因组、转录、转录后、翻译、翻译后水平。基因表达的调控因子：蛋白质 ( 主要 )、小分子RNA ( 某些环节 )二、基因表达的时间性及空间性（一）时间特异性按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称为基因表达的时间特异性(temporal specificity)。如细菌、病毒感染。 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性(stage specificity)。如受精卵发育。（二）空间特异性在个体生长全过程，某种基因产物在个体不同组织器官表达

3、存在差异，称为基因表达的空间特异性(spatial specificity)。基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。三、基因表达的方式按对刺激的反应性，基因表达的方式分为：（一）组成性表达某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(housekeeping gene)。如编码催化三羧酸循环反应的酶的基因。无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。这类基因表达被视为组成性基因

4、表达(constitutive gene expression)。（二）诱导和阻遏表达在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。如修复酶基因。如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。如色氨酸合成酶相关基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为协调表达(coordinate expression)，这种调节称为协调调节(coordinate regulat

5、ion)。四、基因表达调控的生物学意义（一）适应环境、维持生长和增殖（二）维持个体发育与分化 线虫 胚胎期：1090个细胞，成虫：959个细胞，131个细胞在发育过程中发生凋亡。五、基因表达的调控水平 基因组、转录、转录后、翻译、翻译后第一节 原核生物基因表达的调控原核生物基因表达调控主要在转录水平，其次是翻译水平。本节主要以大肠杆菌为例介绍原核生物基因表达的调控。一、 原核生物基因表达的特点原核生物是单细胞生物，没有完整的核膜和核结构，其基因表达特点如下： （1）只有一种RNA聚合酶。RNA聚合酶用来识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。（2）原核生物的基因表达以操纵子为基本单位。 操

6、纵子（operon）：指一个多顺反子转录单位与其调控序列。 特异DNA序列编码序列 启动序列 操纵序列 其他调节序列(promoter)(operator)多顺反子mRNA (polycistronic mRNA):原核生物的一个mRNA分子带有几个结构基因的遗传信息，利用共同的启动子及终止信号，组成操纵子的基因表达调控单元。PromoterGene 1Gene 2Gene 3Terminator单顺反子mRNA(monocistronic mRNA):真核生物的一个编码基因转录生成一个mRNA.（3）转录和翻译是偶联进行的：原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，转录成mRNA后，直接在胞浆

7、中与核糖体结合翻译成蛋白质。 （4）mRNA翻译起始部位有特殊的碱基序列SD序列：在起始密码AUG上游413个碱基之前有一段富含嘌呤的序列，其一致序列（consensus sequence）为AGGAGG，称为SD序列（Shine-Dalgarno sequence）。此处能与核糖体30S亚基中16S rRNA 3端富含嘧啶的序列互补配对结合，与蛋白质合成过程中起始复合物生成有关。（5）原核生物基因表达的调控主要在转录水平，即对RNA合成的调控。通常有两种方式：一种是起始调控，即启动子调控；另一种是终止调控，即衰减子调控。二、 原核生物基因表达的调控（一）转录起始的调控1因子与转录起始的调控因

8、子调控RNA 聚合酶与DNA结合。确保RNA 聚合酶与特异启动区稳定结合，而不是与其它位点结合。 例如:大肠杆菌RNA 聚合酶由5个亚基（2）构成，核心酶（2 ）能以DNA为模板合成RNA，但必须依靠因子协助才能在正确位置起始转录。 机理：因子含有识别启动区的结构域。a.因子独立存在时，N端部分抑制了C端的 DNA结合活性，与DNA不能结合。b.当因子与核心酶组成全酶时，空间构象改变，N端对C端抑制作用消失，可与DNA发生特异结合。c.转录起始完成后因子脱落，核心酶不再停留在启动区部位，向下游滑动完成转录。原核生物启动子的序列具有较强的保守性共有序列(consensus sequence) 决

9、定启动序列的转录活性大小。某些特异因子（蛋白质）决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力。细菌启动区特异序列有4个保守特征:起始点：第一个被转录的核苷酸（+1）90%以上为嘌呤核苷酸。“10”序列：在转录起始点上游 -10 bp，一致序列为TATAAT。“35”序列：在起始点上游 -35 bp ，一致序列为TTGACA。“35”和“10”序列的间距：距离长短对RNA聚合酶结合具有重要影响。操纵基因在操纵子的位置是从-7至+28，RNA聚合酶所占的区域是从-35至+20，两者有部分重叠，因此阻遏蛋白和RNA聚合酶与DNA的结合是相互排斥的。2转录起始的负调控乳糖操纵子(lac

10、operon)包括三个结构基因： Z（编码-半乳糖苷酶）、 Y(编码乳糖透性酶)和 A（编码半乳糖苷乙酰基转移酶）。转录调控区紧挨在Z基因上游，调控蛋白与此区结合调节结构基因的转录。编码lac阻遏蛋白的I基因在调控区的上游。乳糖操纵子调控区包括分别能与CAP、RNA 聚合酶及lac阻遏蛋白结合的位点，图中显示经DNA足纹实验所测得的cAMP-CAP、RNA 聚合酶及阻遏蛋白的结合范围（图上部的黑线）。 调控区CAP结合位点启动序列操纵序列 结构基因Z： -半乳糖苷酶Y： 透酶A：乙酰基转移酶ZYAOPDNA(a) 有葡萄糖，没有乳糖存在lac的调控示意图(b) 开始没有乳糖存在，再加入乳糖la

11、c的诱导去阻遏示意图(c) 没有葡萄糖，有乳糖存在lac的调控示意图 3 转录起始的正调控阿拉伯糖操纵子是原核生物转录起始的正调控的典型例子。该操纵子由结构基因B、A、D以及调控元件I1、I2、O1、O2和启动子构成。图 阿拉伯糖操纵子的基因结构图 AraC 对阿拉伯糖操纵子的调节当大肠杆菌以阿拉伯糖为能源生长时，结构基因B、A、D编码产生三种酶：即异构酶（isomerase）、激酶（kinase）和表位酶（epimerase），可催化阿拉伯糖转变为5-磷酸木酮糖，后者可进入糖酵解途径。当不存在阿拉伯糖时，AraC二聚体与O1、O2及I1结合，与O2和I1结合的AraC二聚体间相互作用使DNA

12、弯曲形成环结构（相当于190 bp）。由于I2不被占据，B、A、D基因不发生转录，但有低水平的araC基因转录。当有阿拉伯糖时，AraC二聚体可与阿拉伯糖形成复合物，使AraC形状发生改变，原来与O2和I1结合的AraC二聚体之间的作用不复存在，I1和I2由一个AraC二聚体占据，从而激发B、A、D基因转录。此时，可有一过性高水平的araC mRNA形成，维持到O1-O2环结构形成（图）。4转录起始的复合调控cAMP:环一磷酸腺苷 CAP：分解代谢基因激活蛋白质cAMP与葡萄糖水平相关：葡萄糖浓度高时，cAMP水平很低；葡萄糖缺乏时，cAMP水平升高。 CAP为同二聚体，每个单体含有一个DNA

13、结合区和一个转录激活区。 CAP的活性依赖cAMP，CAP与cAMP结合形成cAMP-CAP复合物，促进多种操纵子的转录起始，是转录起始的正调节物。lac的转录起始：CAP（正）和阻遏蛋白（负）调控。 当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。思考：低半乳糖时高半乳糖时葡萄糖低 cAMP浓度高OmRNARNA-pol葡萄糖高 cAMP浓度低OOlac的转录起始是由CAP和阻遏蛋白两种正、负调控因子来控制的。 （a）有葡萄糖,无乳糖时，阻遏蛋白与操纵基因结合，乳糖操纵子结构基因不转录，cAMP处于低水平，CAP 蛋白不能

14、与启动子附近的CAP位点结合；(b)葡萄糖和乳糖均存在时，阻遏蛋白与乳糖结合，空间构象改变，不再与操纵基因结合， cAMP处于低水平,CAP蛋白不与CAP位点结合，结构基因有少量表达；(c)无葡萄糖，有乳糖时，阻遏蛋白不与操纵基因结合，cAMP处于高水平，形成cAMP-CAP复合物并与CAP位点结合，结构基因大量表达。（二）转录终止的调控色氨酸操纵子的结构基因（E、D、C、B、A）编码的5种酶，在色氨酸合成代谢过程中发挥作用，结构基因中还包括L基因，其转录产物是先导mRNA，调控元件有启动子（P）和操纵基因（O）。色氨酸操纵子表达的调控有两种方式，一种通过阻遏蛋白的负调控；另一种是通过衰减子作

15、用（attenuation）。色氨酸操纵子的结构及其调控方式衰减子对转录的调控 色氨酸操纵子的衰减子位于前导肽编码基因中，离E基因上游约3060个核苷酸。大肠杆菌在无色氨酸的环境下，前导肽编码基因和5个结构基因能转录产生具有6,700个核苷酸的全长多顺反子mRNA，当细胞内色氨酸增多时，E、D、C、B和A基因转录受到抑制，但前导肽编码基因转录出140个核苷酸mRNA引导序列并没有减少，这部分转录称为衰减子转录物。引导序列由一段14氨基酸前导肽编码区和一个衰减子组成，前导肽编码区起始部位有核蛋白体结合位点，AUG密码子后面紧跟13个密码子，第10、11为色氨酸密码子。根据序列特点可将整个mRNA

16、引导序列分为4区，可形成不同的碱基配对结构；1区和2区互补时，3区和4区可以互补配对，形成的发夹结构及随后出现的8个U即构成典型的不依赖因子终止子；1区不能与2区互补时，2区即与3区互补，3区不再与4区互补。4个区域以何种形式配对取决于核蛋白体翻译mRNA引导序列的速度，后者又受控于色氨酸的水平。色氨酸丰富时，核蛋白体可顺利沿引导序列移动直至达最后一个密码子UGA，合成完整的引导肽。UGA位于1区和2区之间，到达此处的核蛋白体占据2区，使3区不能与2区互补而与4区互补，形成终止子发夹结构，RNA 聚合酶停止在衰减子部位。色氨酸缺乏时，核蛋白体因原料缺乏终止在1区Trp密码子部位，2区无法与1区

17、配对且在4区被转录出来之前与3区互补，致4区处于单链状态，不能形成终止发夹，RNA 聚合酶通过衰减子而继续转录。色氨酸操纵子mRNA引导序列不同区域互补所形成的不同二级结构 色氨酸操纵子的转录衰减作用 意义：这种机制可以保证充分地消耗色氨酸，使其合成维持在满足需要的水平，防止色氨酸堆积和过多地消耗能量。同时，也使细菌能够优先将环境中的色氨酸消耗完，然后开始自身合成。（三）翻译水平的调控翻译过程是原核细胞调控某些基因表达的重要环节。翻译一般在起始和终止阶段受到调节。翻译起始的调节主要靠调节分子，调节分子可以是RNA，也可以是蛋白质，调节分子可直接或间接决定翻译起始位点能否为核蛋白体所利用。 1反

18、义RNA：指能与特定mRNA互补结合的RNA片段，反义RNA由反义基因转录而来。天然的具有功能的反义RNA分子一般在200个碱基以下。反义RNA又称mRNA干扰性互补RNA（mRNA interfering complementary RNA, micRNA）。2mic RNA在原核生物翻译水平上有三种作用方式： 反义RNA与mRNA 5端非翻译区包括SD序列相结合。反义RNA与SD序列结合后，阻止mRNA与核糖体小亚基结合，直接抑制翻译。 反义RNA与mRNA 5端编码区起始密码子AUG结合，抑制mRNA翻译起始。 反义RNA与mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构象改变，影响其与核糖体结

19、合，间接抑制了mRNA的翻译。例如：细菌中Tn10转位酶基因低水平的表达亦是通过反义RNA调节的。Tn10转位酶基因由PIN启动子控制，反义RNA的基因由POUT启动子控制。两个启动子方向相反，转录区有35个碱基重叠，互补区覆盖了Tn10转位酶mRNA的翻译起始区，其活性POUT比PIN更强。其结果是转位酶的表达效率非常低，转位作用也极少发生。因而细菌DNA发生突变的机会愈少，使细菌愈易于存活。反义RNA调控Tn10转位酶基因的表达反义控制策略已被用于真核细胞基因表达抑制的实验研究。将表达反义RNA的重组载体导入真核细胞，某些情况下可使靶基因失活。但这种抑制并不像细菌中那样直接阻断翻译起始，反

20、义RNA主要与靶基因转录产物杂交，干扰了RNA在核内的加工过程。有些情况下，反义表达载体并不能抑制靶基因编码蛋白的活性，也许是因为这些蛋白质（如酶）在很低水平就能发挥其应有的作用。3RNA 干扰 (RNA interference, RNAi)将与mRNA编码区某段序列相对应的正义RNA 和反义RNA 组成的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)导入细胞，使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默(表达受抑制)。这种转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS) 被称为RNAi。* dsRNA 导入细胞后，

21、首先被核酸酶解降成21-23个核苷酸 (nt) 小片段,称(short interfering RNA， siRNA). dsRNA降解成小片段的原因可能为： a.增加细胞内小片段体积克分子浓度，使其有效地扩散。 b.dsRNA 降解成21-23 nt 可为同源搜索机制提供最佳特异性。 c. 能与核酸酶有效形成复合体。 RNAi降解mRNA的过程4RNAi 的应用前景* 防御病毒的感染 封闭病毒生存和繁殖所必需的基因，产生抗病毒效应。siRNA 可望成为防治病毒的有力工具，尤其是对RNA 病毒。 * 基因治疗 RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基

22、因。* 肿瘤的基因治疗 RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA 即可以产生多个基因同时沉默。 * 研究基因的功能 由于RNAi 可以特异性抑制特定基因，获得功能丧失，因此可用于功能基因组的研究。5RNAi存在的问题：* 体外合成的RNA易于被RNA 酶分解，同时转染多为瞬时表达。* 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不清楚。* 目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。* 生物体是一个复杂的系统，存在多种机

23、制相互作用以调控基因的表达，RNAi 是否能充分发挥作用？ 第二节 真核生物基因表达的调节 第二节 真核生物基因表达的调控一、 真核生物基因表达的特点 1细胞的全能性：所谓全能性是指同一种生物的所有细胞都含有相同的基因组DNA，即基因的数目和种类是一样的，尽管细胞的类型不同，分化程度也不一样，但它们都有发育成完整个体的潜能。2基因表达的时间性和空间性：所谓时间性是指高等生物的各种不同细胞具有相同的基因组，但在个体发育的不同阶段，细胞中各种蛋白质的组成不一样，就是说基因表达的种类和数量是不同的，所谓空间性指在不同组织和器官中，基因表达的种类和数量不同。3转录和翻译分开进行：真核生物DNA大多与蛋

24、白质结合形成染色体，并由核膜包绕形成细胞核。在核中转录生成mRNA，穿过核膜至胞质指导蛋白质合成；转录和翻译不是同步进行的，受多层次调控。 4初级转录产物要经过转录后加工修饰：初级转录产物核不均一性RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），即mRNA前体分子要经过戴帽(m7GpppN)、加polyA尾、切除插入的内含子和拼接外显子等过程，才能形成成熟的mRNA分子。 5不存在超基因式操纵子结构：真核生物基因转录产物为单顺反子（monocistron），一条mRNA只翻译一种蛋白质。功能相关的基因大多数分散在不同的染色体上，即使空间位置很近，也是分别进行转录。 6

25、部分基因多拷贝：某些基因以多拷贝形式存在，如组蛋白和tRNA等，这样既可满足细胞的需要，也是表达调控的一种有效方式。二、真核生物基因表达的调控信号（一）激素和蛋白质因子对基因表达的调控 激素：1.小分子脂溶性物质，进入细胞，直接对有关基因发挥调节；2.水溶性的多肽或蛋白质，与细胞表面的受体结合，最终影响有关基因的表达。 蛋白质因子：细胞因子、生长因子、粘附蛋白等。（二）外环境因素对基因表达的调控三、真核基因基因表达调控的机制（一）基因组DNA水平的调控1染色质的丢失：一些低等生物（如线虫、原生动物和昆虫等）体细胞发育过程中发生染色质丢失及高等动物红细胞在发育成熟过程中染色质的丢失，都是一些不可

26、逆的调控。2基因扩增（gene amplification）：发育分化或环境条件的改变，使对某种基因产物的需要量剧增，而单纯靠调节其表达活性不足以满足需要，只有增加这种基因的拷贝数（即基因的扩增或基因放大）才能满足需要。3基因重排（gene rearrangement）：基因重排是指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组合，成为一个完整的转录单位。如免疫球蛋白基因在B淋巴细胞分化和浆细胞生成过程中，编码免疫球蛋白分子的许多基因片段发生重排，从而奠定了免疫球蛋白分子的多样性的基础。4基因的甲基化修饰：某些高等生物，尤其在脊椎动物中，DNA上特定的CpG序列处的胞嘧啶可发生甲基化修饰（5mC）。

27、这种DNA的甲基化修饰对真核生物基因的表达具有一定的调控作用。一般认为，基因的甲基化程度与基因的表达呈反比关系。甲基化程度愈高，基因的表达则降低。去甲基化可使基因的表达增加，基因某一特定位点（尤其是靠近5端调控序列）的去甲基化可使基因的转录活性增加。在所有组织发育过程都表达的基因，如看家基因（house-keeping gene）调控区多呈低甲基化，在组织中不表达的基因多呈高甲基化。5染色质结构对基因表达的调控作用：真核生物的染色质或染色体由DNA与组蛋白、非组蛋白和少量RNA及其他物质结合而形成，核小体为其基本结构单位。组蛋白与DNA结合，可保护DNA免受损伤，维持基因组的稳定性，抑制基因的

28、表达。去除组蛋白则基因转录活性增高。这种组蛋白与DNA结合与解离是真核基因表达调控的重要机制之一。（二）转录水平的调控真核生物基因转录水平的调控比原核生物复杂得多，而且转录水平的调控又是真核生物基因表达调控中最重要的环节。调控作用主要是通过反式作用因子与顺式作用元件和RNA聚合酶（RNA polymerase，RNA pol）的相互作用来完成的。调控作用主要表现为反式作用因子影响转录起始复合物的形成。因此，深入了解真核生物基因表达在转录水平上的调控，关键要弄清楚反式作用因子的特点以及反式作用因子对转录起始的调控。1转录起始复合物的形成不论是原核生物还是真核生物，在转录起始复合物形成过程中，RN

29、A聚合酶与启动子的结合都是关键的一步。差别在于细菌的RNA聚合酶识别的是一段单纯的DNA序列，而真核生物的RNA聚合酶识别的是一个由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物。真核细胞的RNA聚合酶不能单纯识别DNA上的启动子。只有当一个或多个序列特异性的DNA结合蛋白（称为转录因子，TF）与DNA结合，形成功能性的启动子后，才可被RNA聚合酶识别与结合。TF是RNA合成起始所必需的因子。TF与原核细胞中的因子不同，因子是先与RNA聚合酶结合形成全酶后，方可识别启动子；因子在启动转录后与RNA聚合酶解离，并且不再结合RNA。而TF是不依赖于RNA聚合酶而独立地结合DNA，并且在转录过程中，

30、促使许多RNA聚合酶分子与启动子的结合。与原核生物单一的RNA聚合酶不同，真核生物RNA聚合酶有三种： RNA聚合酶、。RNA聚合酶 存在于核仁中，其转录产物为rRNA(5.8S、18S和28S rRNA)；RNA聚合酶存在于核质中，其转录产物为mRNA及其他一些小分子RNA如U1-6 RNA；RNA聚合酶存在于核质中，其转录产物为5S rRNA和tRNA。真核生物的RNA聚合酶、分别识别不同的启动子，需要不同的TF，即TF、TF和TF。每一类又依发现先后命名为A、B，如TFA、TFB等。其中，由RNA聚合酶转录的基因称为二类基因。由于此类基因种类多，又与细胞生长、分化直接相关，其表达调控亦最

31、为复杂。现以真核细胞RNA聚合酶为例重点介绍类基因的转录调控。RNA聚合酶分子识别启动子的最低需要是：必须在聚合酶识别启动子之前，与一个TATA盒结合因子（或称TATA因子）形成稳定的转录复合物。这种TATA因子也称为转录因子D（transcription factorD，TFD）。TATA盒的一致性序列（consensus sequence）是T82A93T93A85(A or T)100A83(A or T)83（下角标数字表示核苷酸在一致性序列中出现的频率）。该序列一般位于转录起始位点上游，即2530核苷酸处。TATA盒对于许多编码蛋白质基因的启动子活性和RNA链的起始点决定起关键作用。

32、由于TATA因子为RNA聚合酶转录的基因所需要，所以它更倾向于被视为通用转录组分。体外实验证明，TATA因子一旦与DNA结合，就可形成一个稳定的转录复合物，并介导许多RNA聚合酶分子的转录。RNA聚合酶识别并结合由TATA因子与TATA盒形成的蛋白质-DNA复合物。此时形成的是闭合的复合物，DNA双链没有打开，尚不能启动转录；只有当转录起始因子与RNA聚合酶结合，使DNA部分双螺旋解开成为开放的转录起始复合物（open complex）时，基因转录才开始,可以合成RNA(图5-13)。在转录调控过程中，反式作用因子主要是促进或抑制TATA因子与TATA盒结合、RNA聚合酶与TATA因子-DNA

33、复合物结合以及转录起始复合物的形成。图5-13 真核基因开放的转录起始复合物的形成 2顺式作用元件(cis-acting element)某些能影响基因表达但不编码蛋白质和RNA的DNA序列，按照功能分为启动子、增强子、负调控元件-沉默子。(1) 启动子(promoter)：真核基因启动子是在基因转录起始位点(+1)及其5上游近端大约100200 bp以内的一组具有独立功能的DNA序列。每个元件长度约为720 bp，是决定RNA聚合酶转录起始点和转录频率的关键元件。整个启动子由核心启动子和上游启动子元件两个部分组成（图5-14）。图5-14 真核类基因的顺式作用元件1）核心启动子(core p

34、romoter)：指足以使RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列。其中包括“转录起始位点”即相当于mRNA的CAP位点及其上游2530 bp处的富含TA的典型元件“TATA”盒，即Hogness盒。其核心序列为TATAAAA，与原核生物启动子Pribnow盒相似。核心启动子单独起作用时，其功能为确定转录起始位点并产生基础水平的转录。2）上游启动子元件( upstream promoter element，UPE)：包括通常位于70 bp附近的CAAT盒(CCAAT)和GC盒(GGGCGG)等，其功能是调节转录起始的频率，提高转录效率。 (2) 增强子(enhancer)：指位于启动

35、子上游或下游并通过启动子增强邻近基因转录效率的DNA顺序，但增强子本身不具备启动子活性。增强子一般具有如下特性： 能通过启动子提高同一条DNA链上靶基因的转录效率；对同源和异源基因同样有效； 其位置可在基因5上游、基因内或其 3下游序列中；在DNA双链中没有5与3固定的方向性，即增强子从53或是由35均可对启动子发挥作用； 增强子可远离转录起始位点，通常在14 kb起作用； 一般无基因特异性，对各种基因启动子均有作用，但具有组织或细胞特异性；其活性与其在DNA双螺旋结构中的空间方向性有关。增强子首先发现于SV40病毒中，位于早期启动子5上游约200 bp，内含2个72 bp的重复序列，其核心序

36、列为GGTGTGGAAAG。增强子可促使该病毒基因转录效率提高100倍。 (3) 其他元件：在真核基因内能抑制基因转录的DNA序列，称为负调控元件,亦称为沉默子（silencer）或衰减子（dehancer）。它们与反式作用因子相互结合而起作用。这些负调控元件不受距离和方向的限制，并可对异源基因的表达起作用。此外，在模板DNA分子的5端有转录终止信号，称终止子。通常具有po1yA尾的基因终止信号为GT簇，例如在SV40中的AGGTTTTTT序列为终止转录调控元件。 3反式作用因子(trans-acting factor)反式作用因子指能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件812 bp核心序列

37、上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质，也称序列特异性 DNA结合蛋白(sequence specific DNA binding protein，SDBP)，有时也称转录因子（transcription factor，TF）。这是一类细胞核内蛋白质因子。在结构上含有与DNA结合的结构域，为结合特异DNA序列所必需。根据其作用方式的不同分为三类：通用转录因子： 系多数细胞普遍存在的一类转录因子，如TATA box结合因子 TFD、GC box结合因子SP1 等；组织特异性转录因子：在很大程度上，基因表达的组织特异性取决组织特异性转录因子的存在；诱导性反式作用因子：这些反式作用因子的活性能被特异

38、的诱导因子所诱导，这种活性的诱导可以是新蛋白的合成。 （1）反式作用因子结构域的模式：一个完整的反式作用因子通常含有三个主要功能结构域，分别为DNA识别结合域、转录活化域和结合其他蛋白质的调节结构域。1）DNA识别结合域： 锌指（zinc finger）结构：锌指结构指含有一段保守氨基酸顺序的蛋白质与该蛋白的辅基锌螫合而形成的环状结构，分为锌指、锌扭（twist）和锌簇（cluster）结构；也有按照与锌结合的氨基酸残基性质分为Cys2Cys2和Cys2His2指，即两个半胱氨酸残基（Cys）和两个半胱氨酸残基或两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基(His)通过与位于中心的锌离子以配位键结合，形成

39、一个稳定的指状结构。它们的共同特点是以锌作为活性结构的一部分。在指状突出区表面暴露的碱性及其他极性氨基酸与DNA结合有关。 (1) (2)图（1）Cys2His2锌指结构；（2）Cys2Cys2锌指结构同源结构域（homeodomain，HD）。同源盒基因家族各基因间具有一相同的保守序列，称为同源结构域。该结构域由大约60个左右氨基酸组成，其C 端部分与原核生物阻遏蛋白的螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix）结构区同源，在它所含的至少二个螺旋中，其间由短氨基酸残基形成“转折”，第三个螺旋与DNA大沟相互作用是同源盒蛋白与DNA结合的主要力量。 同源结构域与DNA的结合碱性亮氨酸拉

40、链（basic 1eucine zipper，bLZ）：有些反式作用因子其肽链C末端有一段30个氨基酸序列以-螺旋构型出现的结构单元，其中每间隔6个氨基酸就出现一个亮氨酸残基，能形成两性-螺旋(amphipathic -helix ), 带电荷的亲水性氨基酸（如Lys、Arg 、Asn等）位于一侧，而具有疏水性的亮氨酸残基位于另一侧，两个具有这种结构的因子接触后可借助侧链疏水性交错对插，象拉拉链一样将两个反式作用因子连在一起，形成具有稳定卷曲螺旋结构的二聚体，即亮氨酸拉链。 亮氨酸拉链及与DNA结合的碱性结构域螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）结构:含两个双性-螺旋，每

41、34个氨基酸含一个疏水性残基，中间为非螺旋环区，内含一个或多个能阻断螺旋的氨基酸残基。 两个具有两性-螺旋的蛋白因子形成二聚体 （a、b为两个不同的蛋白因子）2) 转录活化结构域（transcriptional activation domain）：在真核生物中，反式作用因子的转录调控功能并非都需要其直接与DNA结合。具有转录活化域就成为反式作用因子中惟一必须具备的结构基础。转录活化结构域模型有以下几种：A酸性-螺旋（acidic-helix domain）：其结构特点是含有较多的负电荷并能形成亲脂性的-螺旋，在糖皮质激素受体和AP-1/Jun转录因子中也含有此种结构。B富含谷氨酰胺的结构域（

42、glutamine-rich domain） C富含脯氨酸结构域（proline-rich domain）：CTF/NF因子的羧基端富含脯氨酸（20%30%），难以形成-螺旋。4.转录水平的调控机制：（1）反式作用因子的活性调节：真核基因转录起始的调节，首先表现为反式作用因子的功能调节，即特定的反式作用因子被激活后，可以启动特定基因的转录。反式作用因子的激活方式如下。1)表达式调节：反式作用因子合成出来即具有活性，随后被迅速降解。这一类反式作用因子仅在需要时才合成，并通过蛋白水解酶迅速降解，不能积累。2)共价修饰：其一是磷酸化去磷酸化。其二是糖基化。3)配体结合：类固醇激素及其他小分子脂溶性激

43、素（甲状腺素、维生素D3、视黄酸等）作用的受体统称为核受体超家族（nucleic receptor superfamily），均为反式作用因子，其本身对基因转录无调节作用。当激素进入细胞后，核受体超家族通过与配体（激素）结合，进入细胞核与相应的靶基因反应元件结合，调节靶基因转录。所4)蛋白质与蛋白质相互作用：蛋白质蛋白质复合物的解离及形成，是许多细胞内活性调节的一种重要的形式。有些反式作用因子与另一蛋白形成复合物后才具有调节活性。如Myc蛋白是一种调控基因转录的反式作用因子。具有碱性亮氨酸拉链和螺旋-环-螺旋结构域。Myc蛋白与其他亮氨酸拉链蛋白不同，它不能形成同源二聚体，需与含有亮氨酸拉链结

44、构域的Max或Myn蛋白构成异源二聚体，才能调节基因的表达。（2）反式作用因子作用方式：反式作用因子与顺式元件的结合位点通常与其所调控的基因相距较远。它们如何影响到远距离RNA聚合酶结合位点，并影响其转录活性呢？目前提出的有下列几种作用模式。1） 成环（looping）：反式作用因子结合位点与RNA聚合酶结合位点之间的DNA成环，从而使两者直接接触而发挥作用。2）扭曲(twisting)：通过DNA结合蛋白与变形的DNA（如左旋DNA）结合或者结合蛋白具有某种酶活性（如解旋等），使DNA构型改变而发挥作用。3）滑动(sliding)：反式作用因子先结合到特异的位点上，然后沿DNA滑动到另一特异

45、的序列而发挥作用。4）Oozing：一种反式作用因子与其顺式元件的结合，促进另一种反式作用因子与邻近的顺式元件结合，后者又促进下一个反式作用因子与其顺式元件的结合，直到基因的转录起始点，进而影响基因的转录。（3）反式作用因子的组合式调控作用：反式作用因子对基因表达的调控不是由单一反式作用因子完成的，而是由几种因子组合，发挥特定的作用，称为组合式基因调控(combinatorial gene regulation)。单一的调节蛋白对转录的影响可以是正调控，也可以是负调控。在转录水平的调控上，作为反式作用因子的蛋白质对基因表达的调控活性是极其特异而精密的，不同因子的加和、协同或阻遏，决定一个基因的转录。(三)转录后水平的调控1. 5端加帽和3端多聚腺苷酸化及意义 5端加帽:真核生物转录生成的mRNA在转录后，在5端加上7甲基鸟苷 (m7GPPPmNp-)。 意义:保护转录体mRNA不受5外切酶降解，增强mRNA的稳定性，同时有利于mRNA从细胞核向胞质的转运，促进mRNA与核糖体的结合（通过帽结合蛋白介导完成）。3端加尾:转录后在mRNA在3末端加上50150个腺苷酸，即poly(A)尾。意义:保证mRNA在转录过程中不被降解。2. mRNA前体的选择性剪接(alternative splicing)对基因表达的调控作用 （1）mRNA前体的剪