基因工程载体

1、第三章第三章 基因工程载体基因工程载体vectors在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入进入受体细胞进行扩增和表达的受体细胞进行扩增和表达的DNA分子叫载体。分子叫载体。1. 载体载体 （Vectors）（1）具有在宿主细胞中独立地进行自我复制和表达的能力，）具有在宿主细胞中独立地进行自我复制和表达的能力，在受体细胞中扩增较多的拷贝。在受体细胞中扩增较多的拷贝。（2 2）有两个以上容易检测的遗传标记，以赋予宿主细胞以不）有两个以上容易检测的遗传标记，以赋予宿主细胞以不同的表型，便于识别和筛选同的表型，便于识别和筛选 。（3）具多个限制性内切酶的单一切点（单一切

2、点越多，越易具多个限制性内切酶的单一切点（单一切点越多，越易选择合适的酶，保证目的基因的完整性，单一切点最好位选择合适的酶，保证目的基因的完整性，单一切点最好位于选择标记基因内，便于筛选重组体）。于选择标记基因内，便于筛选重组体）。（4 4）载体）载体DNADNA的分子量应较小，可插入较大的外源的分子量应较小，可插入较大的外源DNADNA片段，片段，而不影响其自身的复制。而不影响其自身的复制。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。）容易从宿主细胞中分离纯化。2. 基因工程对载体基因工程对载体 的要求的要求 基因工程中常用的载体：基因工程中常用的载体： 3. 载体载体 的种类的种类按功能分：克隆载体

3、与表达载体按功能分：克隆载体与表达载体按宿主分：原核按宿主分：原核载体：细菌质粒、载体：细菌质粒、 phagephage、M13M13单链单链phagephage、CosmidCosmid。 真核载体：真核载体：SV40载体、人工染色体、酵母质粒、载体、人工染色体、酵母质粒、植物转化载体。植物转化载体。穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector）：指带有两种宿主复制子，因而）：指带有两种宿主复制子，因而能在两种生物体内复制的载体分子能在两种生物体内复制的载体分子 第一节第一节 质粒载体质粒载体 一、质粒（一、质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的是独立于染色体以外的能自主

4、复制的双链闭合环状双链闭合环状DNA分子。分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。质粒的命名：一个小写字母质粒的命名：一个小写字母 p 加加 2-3 个大写字母和数个大写字母和数字，如字，如 pUC18，pDTG1。1、质粒的基本性质、质粒的基本性质（1）质粒的复制）质粒的复制 ： 所有的质粒上都至少有一个复制子，有的质粒（小型）借所有的质粒上都至少有一个复制子，有的质粒（小型）借用宿主细胞的用宿主细胞的DNA复制酶类来复制；有些质粒含有编码专门复制酶类来复制；有些质粒含有编码专门用于质粒复制的酶的基因；小部分质粒靠插入至宿主细胞染色用于质粒复制的酶的

5、基因；小部分质粒靠插入至宿主细胞染色体上随染色体复制而复制。不同的质粒用不同的酶系列，在宿体上随染色体复制而复制。不同的质粒用不同的酶系列，在宿主中进行不同程度的复制。主中进行不同程度的复制。 复制子是一个遗传单位，包括复制子是一个遗传单位，包括DNA复制起点及其相关的复制起点及其相关的调控元件。在质粒中，复制起点是一段特定的调控元件。在质粒中，复制起点是一段特定的DNA片段。长片段。长约几百碱基对，其相关的顺式作用调控元件中含有参与约几百碱基对，其相关的顺式作用调控元件中含有参与DNA合成起始的由质粒或宿主编码的可扩散因子的结合位点。因此，合成起始的由质粒或宿主编码的可扩散因子的结合位点。因

6、此，质粒复制子可被定义为质粒质粒复制子可被定义为质粒DNA中能自主复制并维持正常拷中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的核酸序列单位。贝数的一段最小的核酸序列单位。 质粒的复制子质粒的复制子(replicon)决定其拷贝数，决定其拷贝数，不同的质粒，自身不同的质粒，自身复制能力不同，在宿主细胞内的拷贝数也不同复制能力不同，在宿主细胞内的拷贝数也不同。 质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为基本复制子，质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为基本复制子，它由两部分组成，一是复制原点它由两部分组成，一是复制原点(origin of replication ori)，二是，二是调节复制起始的基因

7、（编码蛋白质或调节复制起始的基因（编码蛋白质或RNA)。 质粒的拷贝数（质粒的拷贝数（copy number）：某种质粒在细菌细胞中）：某种质粒在细菌细胞中的数目。的数目。 根据质粒复制的类型，可将质粒分为根据质粒复制的类型，可将质粒分为2类：类： 严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmid）和松弛型质粒（）和松弛型质粒（relaxed plasmid）多数多数DNADNA重组都采用松弛型质粒，只有当基因产物或多拷贝的克重组都采用松弛型质粒，只有当基因产物或多拷贝的克隆基因对宿主有害时，才用严紧型质粒。隆基因对宿主有害时，才用严紧型质粒。拷贝数拷贝数复制特点复制特点 对氯霉素对

8、氯霉素/壮观霉素反应壮观霉素反应 （抑制蛋（抑制蛋白质合成，阻止细菌染色体白质合成，阻止细菌染色体复制）复制）严紧型严紧型1几个几个 复制伴随着复制伴随着染色体的染色体的DNADNA复制复制 复制停止复制停止 松弛型松弛型10-200 复制与染色复制与染色体体DNA的复的复制无关制无关 继续复制，拷贝数增至继续复制，拷贝数增至2000-3000 质粒中已鉴定的复制子已逾质粒中已鉴定的复制子已逾30个。但是，目前在分子克隆个。但是，目前在分子克隆中常规使用的几乎所有的质粒都带有一个来源于中常规使用的几乎所有的质粒都带有一个来源于pMB1的复制子，的复制子，该质粒最初是从一例临床标本中分离到的该质

9、粒最初是从一例临床标本中分离到的(Hershfield et al.1974)。带有该复制子带有该复制子或亲缘关系与之十分接近的大肠杆菌或亲缘关系与之十分接近的大肠杆菌E1(colE1)复复制子制子(Balbas et al.1986)的质粒在每个细菌细胞中可维持的质粒在每个细菌细胞中可维持15一一20个拷贝。个拷贝。 pMB1/colE1复制子已经被大量改造以增加拷贝数，从而提复制子已经被大量改造以增加拷贝数，从而提高质粒高质粒DNA的产量。高拷贝数的质粒载体广泛应用于分子克隆的产量。高拷贝数的质粒载体广泛应用于分子克隆及几乎所有小片段重组及几乎所有小片段重组DNA(40 oC）时，拷贝数会

10、很快增）时，拷贝数会很快增加到加到1000个以上。个以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等构建。等构建。（4） 插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。标记基因内部。如如pDF41、pDF42、pBR329。抗菌素抗性抗菌素抗性外源外源DNA无抗菌素抗性无抗菌素抗性（5）正选择的质粒载体正选择的质粒载体如如pUR2、pTR262等。等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。能在选择培养基上生长

11、。直接选择转化后的细胞。直接选择转化后的细胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。选择载体。Direct selection vectors（6） 表达型质粒载体表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录录翻译信号控制之下。翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。密码、终止密码的阅读正确。复制起始点复制起始点ORI、选

12、择标记、选择标记、多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I操纵基因操纵基因O启动基因启动基因P核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。转录终止信号区。1）普通载体元件）普通载体元件 表达载体的表达载体的结构结构五、经典的大肠杆菌质粒载体五、经典的大肠杆菌质粒载体1. pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。粒载体。（1）类型）类型天然质粒，属低拷贝型。天然质粒，属低拷贝型。（2）长度）长度9.09 kb。（3）选择标记）选择标记四环素抗性四环素抗性Tetr6个克隆位点：个克

13、隆位点：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I主要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位个位于选择标记于选择标记Tetr的内部）的内部）（4）克隆位点）克隆位点2. ColE1（1）类型）类型天然质粒，属高拷贝型。天然质粒，属高拷贝型。（2）长度）长度6.3 kb。（3）选择标记）选择标记大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）E1和对和对E1免疫的基因（免疫的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每蛋白质合成后，质粒仍然能

14、复制达到每个细胞个细胞1000-30001000-3000拷贝之多！拷贝之多！ colicin E1基因的结构基因的结构ceaimmkil结构基因结构基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 杀死不含有杀死不含有ColE1细菌的原因细菌的原因cea + kil基因产物基因产物 不被其他细菌的不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因所杀死的原因imm基因基因EcoR I位于位于E1内部，插入外源内部，插入外源DNA会导会导致致E1失活，使受体菌不能合成失活，使受体菌不能合成E1（ColE1- -），但仍然表现出对），但仍然表现出对E1免疫型免疫型（ImmE1+ +）。）。EcoR I（4）克隆

15、位点）克隆位点Colicin E1外源外源DNA无无Colicin用对外源用对外源colicin E1的免疫性和自身不能的免疫性和自身不能合成合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。作选择，操作非常繁杂。对对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变敏感的细菌群体中自发突变产生抗产生抗colicin E1的频率很高！的频率很高！（5）ColE1的选择缺陷的选择缺陷ColE1抗抗 colicinE1杀杀ColE1- -仍抗仍抗 colicinE1不杀不杀ColE1- -插入片断插入片断ColE1pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因3. pBR322：（1）元件来源）元件来源F. B

16、olivar和和R.L. Rodriguez人工构建载体。人工构建载体。 复制起点复制起点 oripMB1系列（来源于系列（来源于ColE1）的的高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。（2）长度）长度4363bp（3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点）克隆位点其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）；3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24个克隆位点。个克隆位点。（5）p

17、BR322的优点的优点 双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能

18、通过接合转移。不能通过接合转移。 高拷贝数高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。10kb的的DNA在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mob）的）的作用位点作用位点。（6）pBR322的缺点的缺点能够被能够被ColK质粒编码的质粒编码的mob蛋白识别，蛋白识别，如果再有如果再有F质粒的参与，就有可能转移！质粒的参与，就有可能转移！ 删除删除mobmob识别位点识别位点（如质粒（如质粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：从从pBR322上切去上切去HaeII片断，既除片断，既除去了去了mob识别位点，又增

19、加质粒的识别位点，又增加质粒的拷贝数。拷贝数。（7）pBR322的改进的改进pBR325：在在pBR322位点上接入一段来自噬菌位点上接入一段来自噬菌体体PICm的的HaeII酶切片断（带有氯霉酶切片断（带有氯霉素抗性基因素抗性基因cmlr）。）。cmlr上也带一个上也带一个EcoRI位点位点。使使EcoRI 也成为插入失活型位点。也成为插入失活型位点。 改造改造EcoR I 位点位点4. pUC系列系列University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基础上改的基础上改造而成。属正选择载体。造而成。属正选择载体

20、。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 复制起点复制起点pBR322的的 ori但其上失去了克隆位点。但其上失去了克隆位点。 Ampr 基因基因（1）元件来源）元件来源 lacZ的启动子的启动子大肠杆菌大肠杆菌 lacZ基因基因大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的 -肽链序列，肽链序列， 是是LacZ 的氨基端片断。的氨基端片断。pBR322的的Ampr基因基因（2）长度）长度约约2.7kb（3）克隆位点）克隆位点10个连续的单一限制酶切位个连续的单一限制酶切位点，位于点，位于lacZ基因的基因的5端。端。pUC18/19Ampicillin 抗性抗性和和 la

21、cZ的的 肽互补肽互补（蓝白（蓝白斑）相结合。斑）相结合。（4）选择标记）选择标记蓝白斑选择原理：蓝白斑选择原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把无色的化合物能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个分解成半乳糖和一个深蓝色深蓝色的的物质物质5-溴溴-4-氯靛蓝。氯靛蓝。Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Xgal显色反应：显色反应： lacZ的的 肽互补肽互补1） -肽（肽（ lacZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断端的

22、一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在只有在4 4聚体的状态下才有功能聚体的状态下才有功能. .C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚体聚体2）受体菌）受体菌lacZ突变（突变（lacZM15）受体菌基因组的受体菌基因组的 -半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失氨基端有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解聚体的活性酶，不能分解Xgal 受体菌株：受体菌株：JM系列系列、TG1、TG2、XL1-blu

23、e、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC质粒载体上的质粒载体上的lacZ 编码编码 肽与这个肽与这个缺失突变的缺失突变的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，使，使它能形成它能形成4聚体。又能分解聚体。又能分解Xgal。产生。产生蓝色物质。蓝色物质。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ受体菌受体菌lacZ3）载体）载体lacZ与与 互补互补4） 互补的插入失活互补的插入失活pUC载体上载体上LacZ的的5端有一段多克隆位端有一段多克隆位点点(MCS)区，本身虽不干扰区，本身虽不干扰LacZ的合的合成，但插入外源基因就会阻止成，但插入外源基因就

24、会阻止LacZ的的合成。不能互补。合成。不能互补。 lacZ53 肽移码突变肽移码突变lacZ53 肽肽不互补不互补互补互补MCS外源外源DNA IPTG的诱导作用的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。能诱导是乳糖的类似物。能诱导lac操操纵子的启动转录，使受体菌基因组中纵子的启动转录，使受体菌基因组中的的lacZ 的的C端部分端部分和载体的和载体的lacZ 肽肽都表达。从而互补。都表达。从而互补。但载体但载体MCSMCS上插入外源上插入外源DNADNA后，仍然后，仍然不能产生不能产生 肽！肽！IPTG通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有是否有DNAD

25、NA插入。插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：诱导的结果：无质粒的无质粒的受体菌受体菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；无抗菌素抗性无抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养无菌斑无菌斑生长生长质粒转化质粒转化的受体菌的受体菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被载体产物缺失被载体产物 互补，能分解互补，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基

26、上培养养基上培养有蓝色有蓝色菌斑生菌斑生长长带外源带外源DNADNA插插入的质粒转化入的质粒转化的受体菌的受体菌载体产物失活，载体产物失活，不能互补不能互补 - -半半乳糖苷酶的缺乳糖苷酶的缺失。不能分解失。不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有白色有白色菌斑生菌斑生长长（5）pUC系列载体的优点系列载体的优点 更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18为为2682bp，pUC8为为2750bp。 选择方便选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择。显色、抗菌素双重直接选择。 克隆便利克隆便利具有多克隆位点（

27、具有多克隆位点（MCS），使有两个不），使有两个不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。 测序方便测序方便pUC的的MCS与与M13噬菌体载体的噬菌体载体的MCS完完全相同，便于把外源全相同，便于把外源DNA转移到转移到M13载载体上测序。体上测序。M13mp18的多克隆位点的多克隆位点11六、其它质粒载体六、其它质粒载体1. pGEM-3Z由由pUC派生而来。派生而来。与与pUC的主要区别是在的主要区别是在MCS的两侧分别的两侧分别加了一个噬菌体加了一个噬菌体启动子启动子T7和和SP6。T7启动子启动子SP6启动子启动子MCSlacZAmprori可被可被T7和和SP

28、6的的RNA聚合酶识别转录。聚合酶识别转录。 如果加入纯化的如果加入纯化的T7或或SP6 RNA聚合酶，聚合酶，在试管里就可以转录在试管里就可以转录mRNA 外源基因正接反接都可以转录。外源基因正接反接都可以转录。 MCS与与pUC18的完全一样。的完全一样。2. pGEM-4Z：与与pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7启动子和启动子和SP6启动子的启动子的位置互换位置互换。（1 1）pGEM-3Z的特点：的特点：3. 穿梭质粒载体穿梭质粒载体（1 1）穿梭质粒载体的结构）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的点和选择标记

29、、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。寄主细胞中存活和复制的质粒载体。Yeast复制起点复制起点E.coli复制起点复制起点E.coli选择标记选择标记Yeast选择标记选择标记MCS大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体（2 2）常用的穿梭质粒载体）常用的穿梭质粒载体（3 3）穿梭载体的优点）穿梭载体的优点 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 可以自如地在两种不同寄主细胞之可

30、以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。间来回转移基因。克隆、构建克隆、构建表达表达E.coliAnimal cell 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达利用大肠杆菌进行基因克隆、表达七、质粒载体的不稳定性七、质粒载体的不稳定性1. 质粒稳定遗传必须的两个条件：质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次）每个世代、每个质粒至少要复制一次（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分 配到两个子细胞中。配到两个子细胞中。有主动分配和随机分配两种假说。有主动分配和随机分配两种假说。（1）主动分配）主动分配天然质粒。天然质粒。2. 质粒分配方式质粒分

31、配方式具有一个控制质粒拷贝分配的功能区具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），能以主动分配的方式确保质），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。粒能正确分配到两个子细胞中。人工构建的质粒载体人工构建的质粒载体缺失了缺失了par区区，只，只能以随机分配方式分到子细胞中。能以随机分配方式分到子细胞中。人工质粒。人工质粒。（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（2）随机分配）随机分配但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁

32、殖成无胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。质粒的优势群体。3. 分离的不稳定性分离的不稳定性（segregation instability）4. 结构的不稳定性结构的不稳定性（structural instability）寄主基因组的寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。或缺失。ISdimer重组重组（1）新陈代谢负荷：）新陈代谢负荷：5. 影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素使寄主细胞生长减缓：使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约质粒载体使寄主的世代时间延长

33、约15%。 复制负荷复制负荷减缓的程度与质粒的分子量成正比。减缓的程度与质粒的分子量成正比。 转录和翻译负荷转录和翻译负荷丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。全相同，称差度。（2）质粒载体的拷贝数）质粒载体的拷贝数低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。差度（差度（variance）：）：是产生无质粒细胞的重要原因。是产生无质粒细胞的重要原因。高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。贝数的菌

34、体多，发生丢失的可能性大。野生型野生型E.coli中，质粒在寄主的中，质粒在寄主的重组酶重组酶作作用下会发生重组形成用下会发生重组形成二聚体质粒二聚体质粒。（3）寄主菌的重组体系）寄主菌的重组体系二聚体灾难（二聚体灾难（dimer catastrophe）：）：含有大分子量插入片断的质粒载体普遍含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。能形成质粒寡聚体。二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。导致质粒失控。八、常用宿主菌八、常用宿主菌 ： 宿主菌株不仅是质粒制备过程中不纯物的主要来源，也宿主菌株不仅是质粒制备过程中不纯物的主要来源，也是影响质

35、粒是影响质粒DNA的质量的重要因素，因此，选择合适的宿主的质量的重要因素，因此，选择合适的宿主菌株可以减少最后纯化的工作量，例如，避免使用高产碳水菌株可以减少最后纯化的工作量，例如，避免使用高产碳水化合物的菌株和选用低产核酸酶的菌株化合物的菌株和选用低产核酸酶的菌株(end-)，质粒加工过程，质粒加工过程中的稳定性就会大大增加。中的稳定性就会大大增加。Urthaler等用相同的质粒分别转化等用相同的质粒分别转化两种菌株两种菌株JM108和和DH5a，培养提取质粒，培养提取质粒DNA后，比较发现从后，比较发现从菌株菌株JM108中提出的质粒多而且结构均一，明显优于从菌株中提出的质粒多而且结构均一

36、，明显优于从菌株DH5a中得到的质粒。中得到的质粒。 表达载体对宿主菌的要求更严格。表达载体对宿主菌的要求更严格。 常用的宿主菌：常用的宿主菌：DH5 、DH10b、JM101109、HB101和和C600 。 菌株特点：菌株特点：rec+发生缺失，发生缺失，LacZ基因缺失。基因缺失。九、转化子与重组子的筛选方法九、转化子与重组子的筛选方法转化子：转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子转化子：转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子 重组子：含有插入片段的转化子重组子：含有插入片段的转化子1、插入失活：抗性基因中有适当分布的酶切位点，当外源、插入失活：抗性基因中有适当分布的酶切位点

37、，当外源DNA插入，抗药性基因即被破坏。插入，抗药性基因即被破坏。2、-互补（互补（-complementation）：）： 载体中带有载体中带有E.coli lac操纵子的调节序列和编码操纵子的调节序列和编码 半乳糖苷半乳糖苷酶酶N-末端末端146个氨基酸的序列（个氨基酸的序列（-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽段，多克隆肽段，多克隆区域位于区域位于 此区域此区域 ），并受），并受IPTG（Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside，也称，也称Isopropyl -D-thiogalactoside，中，中文名为异丙基文名为异丙基-D-硫代半乳糖苷）诱导合成。宿主带

38、有硫代半乳糖苷）诱导合成。宿主带有lac其它其它部分序列（部分序列（-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽段）；载体与宿主编码的片段肽段）；载体与宿主编码的片段本身没有活性，但它们互相协助可在本身没有活性，但它们互相协助可在E.coli内形成一个具有酶活内形成一个具有酶活性的蛋白质，故性的蛋白质，故IPTG和和X-gal（X-Gal也称也称5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactopyranoside或或5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactoside， 中文中文名为名为5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳半乳糖苷糖苷）培养）培养

39、基上形成兰色菌落；当多克隆位点中插入外源基上形成兰色菌落；当多克隆位点中插入外源DNA， 半乳糖半乳糖苷酶苷酶N端失活，菌落红色。端失活，菌落红色。 lacZ 基因是乳糖基因是乳糖 lac 操纵子中编码操纵子中编码 -半乳糖苷酶的基因，半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可诱导其表达。乳糖及其衍生物可诱导其表达。 乳糖既是乳糖既是 lac 操纵子的诱导物，操纵子的诱导物，也是作用的底物。异丙基也是作用的底物。异丙基-D- 硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖）是乳糖的衍生物，可作为的衍生物，可作为 lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；物； 5-溴

40、溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷（半乳糖苷（X-gal） 可作为可作为 lac 操纵操纵子的底物，但不能作为诱导物。底物子的底物，但不能作为诱导物。底物 X-gal 还可充作生色剂，还可充作生色剂，被被 -半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。兰色。3、正选择：、正选择：正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌，来自淀粉

41、水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基，编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。用于插入失活筛选重组子。4、快速鉴定：菌体、快速鉴定：菌体PCR 菌体裂解直接电泳菌体裂解直接电泳5、抽提质粒、酶切电泳检测、抽提质粒、酶切电泳检测 6、杂交筛选（大量筛选用）、杂交筛选（大量筛选用） 菌落原位杂交菌落原位杂交7、表达筛选、表达筛选 单克隆抗体，免疫反应单克隆抗体，免疫反应十、质粒载体的优缺点十、质粒载体的

42、优缺点优点：优点：1、大量抽提操作简单，转化、大量抽提操作简单，转化 E.coli容易，重复性高。容易，重复性高。2、用途广：转录、测序、亚克隆、表达等、用途广：转录、测序、亚克隆、表达等 缺点：缺点：1、容量小，插入片段小于、容量小，插入片段小于10kb(15kb)，插入片段过大，导致，插入片段过大，导致重组子扩增速度慢，甚至使插入片段丢失。重组子扩增速度慢，甚至使插入片段丢失。 2、大量筛选筛选困难。、大量筛选筛选困难。3、氯化钙法转化效率相对较低、氯化钙法转化效率相对较低 十一、质粒的转化十一、质粒的转化1、感受态细胞的概念、感受态细胞的概念 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外

43、源所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。 cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积制备出

44、的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的的无菌甘油或无菌甘油或-70保存（有效期保存（有效期6个月）。个月）。 2、转化的概念及原理、转化的概念及原理 ： 在基因克隆技术中，转化特指将质粒在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构或以其为载体构建的重组建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学等化

45、学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法（大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由法），该法最先是由Cohen于于1972年发现的。其原理是细菌处于年发现的。其原理是细菌处于0，CaCl2的低渗的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中

46、的DNA形成抗形成抗DNase的羟基的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热短时间热冲击处理，促使细胞吸收冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。子。 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到处理的感受态细胞，其转化率一般能达到51062107转化子转化子/ug质粒质粒DNA，可以满足一般的

47、基因克隆，可以满足一般的基因克隆试验。如在试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高化率提高1001000倍。倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在感受态细菌可以在-70保存，因此被广泛用于外源基因的转保存，因此被广泛用于外源基因的转化。化。 除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受

48、态，依靠短暂的电击，促使诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化进入细菌，转化率最高能达到率最高能达到1091010转化子转化子/ug闭环闭环DNA。因操作简便，愈来愈。因操作简便，愈来愈为人们所接受。为人们所接受。 原理是以高电压原理是以高电压(数千伏数千伏 )在很短时间在很短时间(微秒时间微秒时间)内脉冲电击内脉冲电击细菌细胞，使细胞膜产生许多小孔，质粒细菌细胞，使细胞膜产生许多小孔，质粒DNA通过这些小通过这些小 孔进入孔进入菌体而转化。针对不同的菌株，需要优化各种参数，包括电场强菌体而转化。针对不同的菌株，需要优化各种参数，包括电场强度、脉冲长度、脉冲度、脉冲长度、脉

49、冲 次数、电极与样品的距离以及细菌和次数、电极与样品的距离以及细菌和DNA浓浓度等。更高的电压、更长的脉冲时间虽然能提度等。更高的电压、更长的脉冲时间虽然能提 高转化率，但细菌高转化率，但细菌的存活率降低。的存活率降低。 电穿孔法操作简单，制备用于电穿孔的细菌比制备感受态电穿孔法操作简单，制备用于电穿孔的细菌比制备感受态 菌容易。细菌生长到对数中期后加以冷却，离心，然后用低菌容易。细菌生长到对数中期后加以冷却，离心，然后用低盐缓冲液充分清洗以降低细菌悬盐缓冲液充分清洗以降低细菌悬 液的离子强度液的离子强度,但不必形成原但不必形成原生质体。然后用生质体。然后用10%甘油重悬细菌，使其浓度为甘油重

50、悬细菌，使其浓度为31010细菌细菌ml，在干冰上速冻后置，在干冰上速冻后置贮存。这样，每小份细菌贮存。这样，每小份细菌融解后即可用于转化，融解后即可用于转化， 其有效期至少为其有效期至少为6个月。电穿孔在低温个月。电穿孔在低温下下(04)进行，如果在室温下操作，转化效率可能进行，如果在室温下操作，转化效率可能 会降低百会降低百倍。倍。 3、感受态细胞制备及转化中的影响因素：、感受态细胞制备及转化中的影响因素： 、细胞的生长状态和密度、细胞的生长状态和密度 最好从最好从-70或或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存

51、在感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4的培的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5107个个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的培养液的OD600控制。控制。 （应注意（应注意OD600值与细胞数之间的关系值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。 此外，受体细胞一般应是限制此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性

52、内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。所转化的载体性质相匹配。、质粒、质粒DNA的质量和浓度的质量和浓度 用于转化的质粒用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体溶液的体积不应超过感受态细胞体积的积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的的cccDNA即可使即可使50ul的

53、的感受态细胞达到饱和。感受态细胞达到饱和。 对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，的重组质粒将很难进行转化。此外，重组重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高转化率较分子量相同的线性重组质粒高10100倍，因此重组倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。大都构成环状双螺旋分子。、试剂的质量、试剂的质量所用的所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配

54、制，等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于最好分装保存于4。、防止杂菌和杂、防止杂菌和杂DNA的污染的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂酶或杂DNA所污染，否则所污染，否则均会影响转化效率或杂均会影响转化效率或杂DNA的转入。的转入。、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化

55、率将会降低。否则细胞转化率将会降低。 第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒（噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。）。一、噬菌体的一般特性一、噬菌体的一般特性结构：结构：蛋白质外壳内包裹蛋白质外壳内包裹着着DNA（双链、单（双链、单链、线性、环状链、线性、环状等）。等）。single linear DNA (about 182,000 bp)T2 Genomic DNAT4 Bacteriophage分为两种：分为两种：1. 溶菌周期：溶菌周期：二、噬菌体的生活周期二、噬菌体的生活周期感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳

56、，重新组装成噬菌体颗粒，并白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。菌体。烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage)2. 溶原周期：溶原周期：感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌整合到细菌的染色体的染色体DNA中。形成这一过程称为溶中。形成这一过程称为溶源化（源化（lysogenization)。整合到细菌染色体的噬菌体整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为称为原原噬菌体噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。，随细菌的染色体复制而复制。温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage)原噬菌体（原噬

57、菌体（prophage)：三、单链噬菌体载体三、单链噬菌体载体单链环状单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：的丝状大肠杆菌噬菌体：（2）复制型（）复制型（RF）是双链环状）是双链环状DNA。1. 单链单链DNA噬菌体的特点噬菌体的特点（3）RF DNA和和ssDNA都能转染感受态都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。大肠杆菌。并产生噬菌斑。（5）可产生大量的含有外源）可产生大量的含有外源DNA插入片插入片 断的断的单链分子单链分子，便于作探针或测序。，便于作探针或测序。（1）+DNA。（。（ssDNA）（4）不存在包装限制。）不存在包装限制。2. M13 噬菌体噬菌体RF dsDNA在寄主细胞

58、内以高拷贝形式在寄主细胞内以高拷贝形式存在。存在。成熟的噬菌体里只包装有成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也，也容易提取。容易提取。M13噬菌体只感染噬菌体只感染雄性雄性大肠杆菌。大肠杆菌。但但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。可以转染雌性大肠杆菌。6407 bp。（2）DNA长度长度（3）DNA提纯提纯（1）寄主）寄主M13序序列列（4）M13的生活周期的生活周期虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的长变慢，约为正常的1/21/23/43/4）M13通过雄性细菌的通过雄性细菌的F性须性须注入其注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，

59、形成RF dsDNADNA转录转录mRNA、合成、合成+DNA、翻译形、翻译形成噬菌体蛋白成噬菌体蛋白组装成新的噬菌体组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞挤出寄主细胞+DNA-DNAmRNAM13外壳蛋白外壳蛋白组装成子代组装成子代M13+DNA注入大肠杆菌注入大肠杆菌复制复制转录转录翻译翻译+DNA指导合成指导合成+DNA200个个 RF DNA每个细胞可以放出约每个细胞可以放出约10001000个个M13M13颗粒！颗粒！M13的包装过程：的包装过程：RF dsDNA指导合指导合成的成的+DNAM13基因基因V编码单编码单链链DNA结合蛋白结合蛋白DNA-蛋白质复合物蛋白质复合物转移到寄主

60、的细胞膜转移到寄主的细胞膜M13外壳蛋白外壳蛋白基因基因V蛋白脱落蛋白脱落+DNA溢出细胞膜溢出细胞膜包装包装（5）没有包装限制）没有包装限制3. M13载体的构建：载体的构建：M13基因组中只有基因基因组中只有基因II与基因与基因IV之间之间存在一段存在一段507bp的基因间隔区。的基因间隔区。（1）克隆区域的选定）克隆区域的选定 基因间隔区（基因间隔区（intergenic region, IG区）区）IG区内只有一个区内只有一个 BsuI 切点。切点。其余其余9个个BsuI限制性位点分布在其它部位。限制性位点分布在其它部位。 酶切位点酶切位点M13J. Messing证明，证明，IG区存