抗体工程对于肿瘤的治疗

1、抗体工程对于肿瘤的治疗摘要：过去的20年单克隆抗体（mAbs）发展成为一种治疗包括癌症在内的各种适应症的主要疗法。mAbs演化到癌症治疗的前沿，需要在隔离和优化方面有着显著的优点。本章讨论了促进这种演化的步骤，以及驱动治疗癌症的下一代单抗的标准。10.1引言在20世纪早期，Paul Ehrlich幻想能制造一种专门针对癌细胞且对健康的细胞无伤害的靶向治疗剂。在过去的几十年里，抗体工程的发展使得抗体治疗领域从最初的使用啮齿动物衍生抗体到今天用日益复杂的方法来生产和临床测试包括癌症在内的超过66种的完全人类抗体。现代分子生物学的发展为Ehrlich所想象的靶向单克隆抗体的生产开辟了路径。现在单抗是

2、发展最快的医药行业。美国食品和药物管理局已经批准了超过20种治疗多种疾病的 mAbs，其中包括10种治疗癌症的药物。这些相当于2009年200亿美元的年收入。10.2 抗体结构癌症治疗的单抗是在体内发挥作用的大的多区域蛋白（150kDa）,他们的药物代谢动力学PK和药效学PD，在开发过程中由大量的变量引导的。在最基础的层面上必须优化目标肿瘤与人体免疫系统的联系。目前所有对抗体治疗药物的批准是依赖自然发生的IgG的结构。IgG是由B细胞产生的最主要的同种型抗体。其双边对称结构如图10.1所示。两个异二聚体，各包括一条重链和一条轻链，二聚成规范的Y字结构。酶法分析产物IgG得到三部分：两个相同的抗

3、原结合片段(Fab)和恒定片段FC。这两部分对定义体内的mAb起到重要作用，在设计mAb 的时候一定要把每一部分考虑在内。Fab被分成不变区和可变区。可变区包括重链可变区Vh和轻链可变区，包括抗原结合部位。与特异性氨基酸组成的六个互补确定区域(CDRs)所定义。6个CDRs(3个来着重链，3个来自轻链)中的每一个CDRs在绑定过程中其到重要作用。重链的CDR3区常发挥重要作用。CH2、CH3组成的Fc区与IgG的半衰期和免疫学效应有关，如有针对的杀死细胞以及免疫清除。生物半衰期由位于内皮细胞表面的新生儿的Fc受体控制。该受体可使IgG通过胎盘屏障。在成人中作为循环系统中IgG的救助recepe

4、tor。Fc介导ADCC作用、触发补体级联反应。IgG同型性抗原因为与FC区的不同结合而命名，且生物学效应不同。对影响体内抗体的作用因子的认识越来越多，加上抗体工程技术的进步，使得抗体治疗越加成熟。10.3降低抗体的免疫原性人类免疫系统可以识别并清除外源性蛋白。这同样可以阻止生物疗法，如单抗，在癌症治疗需要将更多的药物存留在血清中。因此要开发能避开患者免疫系统的途径。10.3.1最初的小鼠抗体早期用动物体内的多克隆血清来治疗患者的肿瘤碎片。1895年,Hericourt和Richet(1895)报告用抗血清来改进晚期癌症患者的治疗条件。然而小部分治疗后出现副作用。1975年,科勒和米尔斯汀(1

5、975)用骨髓瘤细胞和B细胞融合产生了第一批单抗。对肿瘤相关抗原的定义及其在临床使用如表10.1所示。由于这些小鼠抗体是外在蛋白，在临床应用时出现HAMA反应。人抗鼠抗体HAMA分为抗同种异型性抗体和抗独特型抗体。抗同种异型性抗体是最常见的反应，专门针对鼠源抗体的Fc片段。抗独特型抗体针对鼠源抗体的可变区，可能会也可能不会结合到靶部位。HAMA反应的发展以及治疗剂量和进度因癌症类型差别很大，由于在病人血清预先存在抗球蛋白抗体。最近发现升级的HAMA在B细胞恶性肿瘤患者中存活时间较长。而大部分HAMA反应可以降低临床反应。HAMA反应可以中和患者免疫系统的小鼠治疗抗体。引发超敏反应。抗体工程用复

6、杂的方法生产人类生殖系列组成的抗体来降低HAMA反应增加免疫疗法的疗效。IgG的从鼠源抗体到完全人源抗体的分类如图10.2所示。下面介绍这些抗体的产生及功能。10.3.2嵌合抗体人类抗体的恒定区与小鼠抗体的可变区结合。人类部分大概占70%。建立嵌合抗体标志着在临床治疗性抗体(表10.1;沙尔丹哈,2009)一个重大突破，该抗体可以抑制反同型HAMA反应，两者都有抗癌活性并能增加其诱导抗肿瘤能力，免疫反应通过高亲和力与Fc受体相互作用上，Fc位于免疫效应细胞的表面(见下文)。尽管人类反嵌合抗体HACA也有记载，但其比HAMA更为罕见。反糖蛋白IIb / IIIa 7 e3小鼠Fab及其嵌合抗体阿

7、昔单抗(Reopro)，在冠状动脉程序作为一种血小板聚集抑制剂，该过程可以说明上述情况。将7E3转化成阿昔单抗可以降低免疫反应，使其从1%降低到17%。尽管HACA概率低，可能不会抑制治疗，但是曾经有接触过HACA抗体的，就妨碍了其进一步治疗。CDRs区占总蛋白量的5-10%，通过生产的“人源化”的抗体其为优化人类生殖细胞系治疗性IgG提供可能。10.3.3人源化抗体治疗癌症药物中4种人源化抗体被批准。CDR移植抗体策略：鼠源抗体mAb的CDRs区移植到人源抗体IgG框架上，在基因水平上生产约90-95%是人类基因的人源化抗体。需考虑一下三个方面：1）确定要移植的鼠源特定的CDR区。2）选择合

8、适的人类基因框架3）识别CDR区以外的人类基因框架，这些区域有可能发生回复突变成鼠源对应的部分来恢复或改善抗体的亲和力。10.3.3.1CDR区的选择抗原抗体的晶体结构能够使其容易识别结合的氨基酸。缺少晶体结构数据的情况下，共同研究了抗体的初级序列及CDR环有限集17或少于60。最近Dunbrack和她的同事通过分析300多种晶体结构数据，精炼了CDR的结构和其预测结构。同种异型抗原是指来自同种生物而基因型不同的个体的抗原物质。如：人类红细胞血型抗原及其组织相容性抗原等。 人类的同种异型抗原主要有：HLA抗原、ABO抗原、Ig的同种异型抗原、Rh抗原。103.3.3重塑抗体CDR环CDR移植抗

9、体作为鼠的CDR和人的框架之间的不兼容结果常表现出减弱的亲和力。为了微调（?重塑?） 抗体CDR环的构象，在可变区框架内（CDR环外）的额外的人类残基可以“背突变?嵌合小鼠。虽然列入额外的小鼠残基会增加免疫原性反应发生的风险，但是这些“背突变?可以大大恢复或提高抗体的亲和力、特异性和表达。除了提供结构支撑，这些框架残留也可能参与抗原结合。抗体的结构模型能够指导选择哪种框架残基来进行背突变而曲妥单抗的设计就是很好的例子。把mu4D5的CDR接合到人IgG1的框架来创建hu4D5-1会产生一个与mu4D5相比近似80倍损失的亲和力和80倍损失的抗增殖作用。背突变一系列的七个框架残基到小鼠身上可以使

10、小鼠恢复生物活性并且增加超过hu4D5-1 250倍的亲和力和超过其父辈mu4D5三倍的亲和力。 设计、生产和测试每个预设计的突变体以增加亲和力的过程可能是乏味的。然而，噬菌体展示提供了一个有效的替代。一个包含在所需位置的小鼠和人的残基的抗体可变结构域的组合文库可以创建和快速筛选较原来的人源化抗体增加了亲和力的突变体。103.3.4重铺可变结构域Padlan提出只有那些暴露在嵌合抗体表面的鼠残基，而不是那些埋在折叠蛋白质疏水区的鼠残基能够引起HACA响应。为了防止B细胞活化和随后的针对鼠可变结构域的体液免疫反应，Padlan采用了一种替换CDR移植的方法，被称作“重铺?或?镶面”。在这种方法中

11、，只有暴露在溶剂中的小鼠可变结构域的嵌合抗体的表面残基是人源化的。一个重铺抗体应该对CDR环提供必要的结构性支持以增加获得减弱的免疫原性的活性抗体的机会。一个关于抗体重铺的综合的草案在别处也被提到过。在体外比较CDR 移植和抗体重铺，结果很类似。尽管目前没有临床上关于重铺抗体的实验数据来证实这一理论，但是带有减少与患者血清反应和HAMA响应的重铺抗体也被制作出来。所以重铺治疗性抗体也被预期有减少患者免疫原性的作用。即使有一个重铺抗体，也有一个可能性，即在重铺抗体核心的小鼠序列可能包含引起免疫应答的T细胞表位，而此细胞表位将会在抗体在细胞内catabolised后呈递。103.4去除T细胞表位即

12、使人类生殖系含量最大化，免疫反应可能仍然会出现，这是由于短的线性肽的存在或位于抗原呈递细胞表面存在于组织相容性复合物II类分子的背景下人源性抗体的构基序的存在。用抗原呈递细胞描述这些肽能激活细胞（T-细胞）对单克隆抗体反应，多个基于硅的方法已被开发，以确定T细胞表位，在努力地“deimmunize?单克隆抗体。其中一个这样的方法就是拉卡尔等人所描述的。称为人类字符串内容（HSC）优化。在这种方法中，人们测量那些在一个给定的单克隆抗体中的较保守的9个氨基酸的肽的字符串与那些在IMGT数据库中人类生殖细胞的抗体中发现的那些较保守的9个氨基酸的肽的字符串进行比例测量。据推测，优化此类生殖细胞抗体将减

13、少免疫原性，因为数据库是由对人体免疫系统具有最低限度的免疫原性的抗体所组成的。以确保所确定的突变不影响抗体的结构完整性，HSC方法采用以序列和结构为基础评分的方法，被称为类似接触环境法（ACE）。HSC和ACE被应用于四个与临床上相关的鼠单克隆抗体上，工程化的衍生物有：抗-CD30单克隆抗体AC10（SGN-30），抗EGFR单克隆抗体225（西妥昔单抗），抗Her2/neu单克隆抗体4D5（曲妥珠单抗），和抗EpCAM的单克隆抗体17-1A（C17-1A）. 新创建的抗体与嵌合抗体或人源化抗体相比改善了HSC，有的甚至在不需要亲和力成熟的情况下比亲本抗体对抗原有更高的亲和力。 此前，消除存在

14、于抗体内的潜在的免疫原性的T细胞表位需要新一代的进行了系统探讨约束力的大型肽库。然而在建模上的进展，如上面所述的方法一样，允许高效的T细胞表位的鉴定，以及随后的被氨基酸替换物所取代。基于对小鼠序列的研究，这种合理的工程方法已被用于开发三个完全人类抗体靶向CD25，血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子。这些人类抗体相当于那些孤立于转基因小鼠和噬菌体展示的抗体，均表现有序列和绑定属性在人源化抗体的设计时，常用的“最适合的”CDR-移植抗体的框架选择方法，如上面所讨论的是基于人受体构架和小鼠或嵌合供体框架的序列的全局相似度。目前正在开发建模的方法，通过确定其序列在人类保留剧目中的典型度来衡量一个潜在抗体的

15、“人性化”程度。迄今为止，这些方法的成功已被无法定义“人性化”和在临床观察到的免疫反应之间的相关性而限制。然而，由于我们对免疫系统的理解的不断发展，努力设计新的建模方法是合理的。103.5人类抗体 在以人性化小鼠抗体的初始方法出台后不久，以促进直接来自人类生殖序列的抗体隔离的技术也被开发出来。这些技术大致可分为两种不同的方法：在体外组装重组的人类抗体库用于噬菌体展示型方法，并在体内产生人类抗体并用转基因小鼠的设计来编码人的immunoglob球蛋白的重、轻链基因。FDA批准的完全人IgG分子已经被这两种方法开发出来，验证其临床效用。第三个方法，人类杂交瘤技术，是一个额外的隔离完全人的治疗性抗体

16、的很有前途的方法。103.51噬菌体展示 除了有助于重塑人源化抗体的CDR环（如上面讨论的），噬菌体显示已成为一个功能强大的工具，创建完全的人类抗体，且在免疫系统中具有最高的亲和力。这种方法的基础在乔治·史密斯表示在丝状噬菌体表面的多肽融合DNA编码在编码病毒衣壳蛋白的噬菌体基因的框架内的多肽时被证明。通过耦合表型（在噬菌体表面表达的一种新的蛋白质）与基因型（分离DNA编码的新型蛋白质的能力），该系统确保有大规模筛选抗体隔离方法。在4年的时间里, 第一个从噬菌体展示文库中分离出的功能抗体来自于一只免疫小鼠。人V基因用捐赠者外周血的杂交瘤的细胞或B细胞采用聚合酶链反应（PCR）进行扩增

17、，导致了含有随机结合的VH和VL片段大型函数库的创建。这些库被分为天然的（从非免疫捐助者）或免疫的（免疫捐助者，使抗体库走向有一定特异度的抗体库）。随后，当单链Fv（SC-抗体）紧接着结合抗原的抗体平移时，携带V基因的噬菌体在其表面表达抗体V的结构域。挑选克隆可以被放大并表示为可溶性的scFv的噬菌体感染大肠杆菌。单链Fv作为初始选择的首要候选人往往是低到中等的亲和力且要求体外亲和力成熟，以获得所需的结合亲和力。这是通过各种各样的突变发生和选择战略，包括CDR突变，连锁洗牌，酵母展示完成的。构建人抗体基因库和抗体选择的一个协议是由Schirrmann和华中科技大学提出的。 阿达木单抗，原始D2

18、E7是第一个获得FDA批准的由噬菌体展示技术创建的全人工单克隆抗体。阿达木单抗是一种用于治疗类风湿关节炎的IgG1抗体。它结合（KD= 6×10-10米），并抑制肿瘤坏死因子（TNF）的活性。 噬菌体展示技术也已经延伸到FAB片段进行抗体生产。此外，新的显示平台纷纷涌现，如酵母，淋巴细胞和核糖体。全合成人组合抗体库的HuCAL（MORPHOSYS，Martinsried，德国），也已经创造模仿人类VH和VL亚科的经常看到的免疫反应。原来，这些合成库只包含随机CDR3编码区，但现在已经被扩展到含有所有六个CDR的编码区。几个的HuCAL抗体现在在临床试验中，包括多发性骨髓瘤BHQ880

19、（诺华），转移性前列腺癌（Centocor公司）的CNTO888，BAY79-4620的晚期实体瘤（拜耳）。10.3.5.2   转基因小鼠Alt和他的同事首次提出了能够编码未重排的人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠有望成为生产人类抗体的有效方法(Alt et al., 1985)。Bruggemann et al. (1989)首先构建了一个携带人免疫球蛋白重链小基因位点的转基因小鼠，该位点包含了融合到commonC区的未重排的V、D、J片段。抗原挑战和杂交瘤细胞的形成表明，这种转基因小鼠能够产生转基因编码的免疫反应。在此之后，两个实验团队构建了另一种转基因小鼠，这

20、种小鼠带有自身免疫蛋白重链和链的靶向断裂基因，小鼠基因中还插入了人免疫球蛋白的大部分基因(Lonberg et al., 1994, Green et al., 1994)。这些转基因株系支持VDJ片段的融合，体细胞突变和类别转换。由此产生了UltiMAb株（Medarex公司，普林斯顿，新泽西州）和XenoMouse株（Amgen公司，加利福尼亚州Thousand Oaks），它们已被用来分离临床验证完全的人类单克隆抗体。据推测(Lonberg, 2008)，转基因小鼠系统中的具有免疫蛋白的天然亲和力的成熟过程，这使得该方法比体外方法更具优势。在体外方法中需要消除主要抗体的后续亲和力的成熟过

21、程，而这些抗体往往是需要用技术分离的抗体，例如用噬菌体显示的方法进行分离。利用XenoMouse技术形成了第一个获FDA批准的单克隆抗体衍生的抗EGFR单克隆抗体帕尼单抗（赫克特等人。，2007，韦纳等人。，2008），（Giusti等人。，2007）创建了T转基因小鼠平台。虽然在临床试验的免疫反应中直接比较的是复杂变量，如实验设计，免疫原性似乎比西妥昔单抗低。231例患者的I期实验（Cutsem等人。，2007）抗人抗体（）的帕尼单抗检测反应与HACA西妥昔单抗反应（Tan等人。，2006。比较缩减到大约4%。也许一个更显著的标是注射帕尼单抗的反应率（5%，无3级或4的不良事件）与西妥昔单抗

22、（7.5%，1.7%，3级或4事件）相比减少。从与转基因鼠源抗体实验相关的大量临床经验中可知，和或嵌合或人源化的单克隆抗体相比，全人类单克隆抗体的整体提高更加清晰这是目前临床开发的不同阶段（朗伯格，2008）。10.3.5.3人杂交瘤细胞人的杂交瘤细胞产生人源抗体，特别是直接从病人的细胞形成的杂交瘤细胞，能理想的消除有害的免疫反应，提高以抗单克隆抗体为基础的治疗效果。明显的，明确的伦理与现实的考虑限制了与鼠源性杂交瘤类似方法的发展，然而，正在寻找替代的方法。从外周血采集抗原特异性B细胞，这容易进行以及可重复的抽取试样，已被用来制作单克隆抗体株（Houghton等。，1983，奥尔森等人，198

23、4，borrebaeck等人。，1988。）清除人免疫需要的其他方法也已经形成。包括人体外脾细胞的免疫（伯尔纳等人。，1991）和体外免疫冷冻保存健康人捐赠的B细胞和随后k6h6B5细胞稳定的融合（Li等人。，2006b）。一些来源于病人的永生细胞系已通过杂交瘤技术制备了人源性抗体（卡帕斯等人。，2001，奥尔森等人。，1984，西科拉等人。，1983）。但是，制备人杂交瘤细胞的主要困难是难以获得或制备出永生人细胞系。人杂交瘤的早期工作通常是外周血中的细胞与可致癌的疱疹家族的病毒（Steinitz等人，1977，科尔等人。，1984），杂交，这些早期的实验具有转化效率低，增长不稳定，和人染色体

24、丢失等缺点（Glassy and Ferrone，1982）。可以通过使用亲和素-生物素交联融合方式（kozbor和罗德，1981）来提高杂交融合效率及产量。或通过EB病毒对B淋巴细胞和异源杂交瘤（人鼠）细胞株融合（Teng et al.，1983，Kudo等人，1988）。可以通过使用morphogenics（尼古拉德斯等人。，1995）方法提高次优杂交瘤的活性，浓度，生长率，这种方法是orphotek的一个特有的过程（埃克斯顿，PA），可以快速的进行错配修复机制以及增加细胞的表型多样性。10.4单克隆抗体有良好的抗癌性能在临床上使用的大多数抗体治疗的机制依赖于抗体自身的抗性，如单克隆抗体的

25、定向能力可以通过免疫系统直接的作用在病人的肿瘤细胞（图10.3A）或者通过抑制信号传导来达到目的（图10.3b）。抗体和细胞工程技术可以改变单克隆抗体的药代动力学和单克隆抗体的药性，以此来增加疗效和明确抗体的生物活性。10.4.1调节血清半衰期和肿瘤定位10.4.1.1受体和血清持久性新形成的Fc受体（FcRn）不仅是调节血清中免疫球蛋白的半衰期的的IgG抗体的半衰期的关键性物质，而且可延长IgG1分子药物的半衰期（约天）。（卡特，2006）。Fc受体是一个二聚体，包含一个50 kDaRn同源的主要组织相容性复合体链和一个15 kDa的非生物多样性 的微球蛋白。第一个受体是在小鼠中发现的（荣汉

26、斯表和安德森，1996），Fc受体可以精确的把IgG从母体通过胎盘运输到胎儿中。在成人中，FcRn在血管内皮细胞中表达，控制（反复观察（ghetie和Ward，2000）和白蛋白（乔杜里等人。，2003）的稳定，使其定位于受体的特定部位（乔杜里等人。，2006）。血清中的IgG抗体通过胞饮作用与在核内体弱酸性条件下（pH值66.5）生成的受体结合，通过一系列复杂的循环回到细胞表面，在生理（pH 77.4）下IgG释放到血清中，使其避免了溶解酶的降解（奥伯等人，2004年a，B。）。IgG破坏的或空间结构错误的IgG不能被受体识别，因此会被溶解酶降解。除此之外，当受体被用完时，过量的IgG会被降

27、解，因此可调节游离的IgG数量。Weinstein和他的同事假设脉管系统周边的高水平的抗原将会作为抗体扩散的结合位点障碍物。Wittrup和他的同事扩展这种结合位点障碍物模型来解释抗体的内化和分解代谢，一旦他们将抗原吸引到细胞表面。如以上详细说明，免疫球蛋白G单克隆抗体的药代动力学行为使他们成为对基于抗体疗法的有利结构。然而，治疗免疫球蛋白G的大面积和高功能性的亲和力被预测会恶化压力梯度和结合位点屏障，从而限制这些抗原渗透肿瘤的能力。当耦合异构抗原的表达，这些影响可能解释不均匀分布系统性管理抗体,这些抗体可以在肿瘤块的活检样本中观察到。虽然，工程抗体的大小和亲和性是独立的特征，当设计一个优化的

28、治疗时他们必须结合起来评估。分子大小和亲和性之间的相互影响以及他们如何影响体内的行为是由Schmid等建模。抗体的大小和扩散至肿瘤速率之间的负相关已经导致预言抗体片段小于完整的免疫球蛋白对于扩散远离肿瘤脉管系统更有效。相反，这促使多种抗体类结构的肿瘤目标属性的创建和测试，其中一些可见于图10.5，如triabodies and tetrabodies已经构建。这些结构最简单的是25 kDa单链可变片段，由肽段连接的V Hand VL区组成。单一链作为构建块创建(scFv)2和双体也作为双功能单一链抗体和BiTEs。额外的的结构没有在图10.5中展现，如已经构建的triabodies and t

29、etrabodies。分子大小对肿瘤渗透的影响是通过一系列绑定到在LS174T人类结肠癌异种移植肿瘤相关糖蛋白72的工程抗体。这份研究数据与假设一致，肿瘤渗透性与抗体分子的大小无关。 小于5065 kDa的抗体进行快速、初步的肾脏的清除。尽管scFv和(scFv)2预计会增加肿瘤渗透性与大的相对物相比，这些蛋白质快速的从循环中清除，限制肿瘤能被实现总的吸收水平。一系列的策略来规避首次通过的清除以及增加治疗单链抗体可变区基因片段的半衰期。PEG融合单链抗体可变区基因片段已经改善了抗体的稳定性和肿瘤的靶向性而没有增加毒性。例如，结合PEG3400到anti-TAG-72双特异抗体或者anti-CE

30、A的双特异抗体带来一个明显的分子大小的蛋白质复合物,等效于一个小型抗体,改善肿瘤肝比率。它被假定聚乙二醇化双体如这些，或者聚乙二醇化单链抗体可变区基因片段如4D5-PEG20可用于成像或细胞毒性的有效载荷的传递。与免疫球蛋白G相似，血清中白蛋白的半寿期通过与FcRn的联系来调控的。许多研究策略被用来开发白蛋白作为一种延长scFv半衰期的机制。白蛋白基因融合的构建是一种方法。例如，一个抗癌胚抗原 单链抗体可变区基因片段-白蛋白 融合蛋白质表明比裸scFv在肿瘤滞留时间提高了2.5倍。另外一个蛋白质，MM-111，临床试验的双特异性anti-Her2/HER3 scFv-albumin融合蛋白也是

31、使用这种方法。另一种策略使用绑定白蛋白的融合运用到治疗抗体上。这些包括多肽类，单区抗体，链状球菌G蛋白质区以及小分子。与白蛋白的非共价亲和性在这种方法可以量身定做,以调整PK和促进白蛋白抗体的离解来增强肿瘤渗透性。 当设计最佳治疗剂时，除了抗体大小还应考虑抗体对目标抗原的亲和性。对目标抗原的亲和性既要能够支持肿瘤的靶向性也能给予期望的生物学效应。相似于抗体的人源化，许多有效的技术用来发展亲和成熟抗体分子。许多基于显示技术,如噬菌体和酵母显示,涉及创建一个“二次”图书馆通过多样化的V基因,和然后选择和筛选高亲和力变体。抗体亲和性的进一步完善可通过CDR-directed 模式方法，在这章抗体人源

32、化的部分讨论过。 亚当斯等人已经显示,使用一组抗-HER2/neu scFv 其亲和力范围是从1.6×106M到1.5×1011M，最高的亲和力的抗体可能事实上是次优的靶向抗肿瘤。免疫球蛋白G的半衰期的调控可通过对免疫球蛋白G CH2-CH3 链交界面进行工程定点突变来完成， Fc片段区域功能是连接FcRn。这种突变可以增加或减少FcRn对免疫球蛋白G片段的亲和力。一些保守的跨物种残基确定对连接FcRn和Fc很中要，其中包括组氨酸310 组氨酸435 和天冬酰胺434。连同FcRn的组氨酸250和组氨酸251.这些Fc域残基赋予了FcRn-IgG相互作用的 pH依赖性。一些

33、抗体已变成在pH为6.0时具有弱FcRn结合性，在中性pH中结合特性未改变，这种结果导致免疫球蛋白G的半衰期延长。此外，血清半衰期延长， FcRn-Fc相互作用半衰期延长已经与临床模式中增强治疗效果有关。Zalevsky等人以创建了抗血管内皮因子的一个变种抗体单伐贝抗，这种抗体称为Xtend-VEGF，它表现出FcRn在pH为6.0时亲和性增加11倍。而且在表达人类FcRn的转基因小鼠上其半衰期延长了5倍，在较长给药间隔的猕猴半衰期延长了3倍.此外，Xtend-VEGF和抗表皮生长因子受体抗体变种西妥昔单抗也称为Xtend-VEGF，都表明对裸鼠有治疗益处。 相反的，半衰期减少的工程抗体可能在

34、免疫结合物的构建或抗体类设想运用是有可行性的。此外，Abdegs是类抗体分子，设计成对FcRn有高度亲和性。它能与体内的抗体竞争。Abdegs能限制FcRn并促使内生抗体的降解，它对一些有关自身免疫抗体的疾病如多发性硬化症和狼疮存在潜在的治疗效果。这些抗体也许对竞争和加速清除免疫毒素和免疫偶联物起作用。10.4.1.2 糖基化蛋白质的糖基化是一种天然共价翻译后修饰，这种修饰能帮助蛋白质适当的折叠，保护蛋白质免于降解并且增强稳定性。此外，在循环中治疗性抗体的存在时间依赖于连接在第297位天冬酰胺位点的氮连接寡糖的结构和特性。从正常血清中分离的人类抗体包含多糖基，这些糖基在可能糖基化氮连接和氧氮连

35、位点的数量和寡糖结构的异质性方面是不同的。氮连接的糖基化在来自正常人类血清抗体的轻链可变区和重链可变区都可以观察到，由于高频突变可以导致氮连接糖基化模式的产生。因为糖基化是与治疗单抗的半衰期和效应功能是相关的，因此它的生物学特性要求考虑到发展和生产中。类似于单克隆抗体主要氨基酸序列促使人源化抗体的开发问题，非人源糖基化模式和与过敏相关的注射有关。因此，最佳的单克隆抗体糖基化为进一步提高效用性和安全性提供可能。重组治疗性单克隆抗体糖基化取决于一些因素包括表达系统的类型，特定酶的存在和活性其中包括将寡糖构建到三聚甘露糖亚胺上的糖基转移酶，糖苷酶降解他们，以及培养基适当的核苷酸提供的可用性。用来表达

36、治疗性抗体的哺乳细胞系是非人类起源的，因此糖基在形式上不同于在人体中所见到的。中国仓鼠卵巢细胞产生糖基化模式不同于人类依据唾液酸连接类型和缺乏对称氮-乙酰葡糖胺。细胞工程策略已经用来开发表达连有对称氮-乙酰葡糖胺(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶。这种以模拟自身人类糖基化形式为目的表达系统的糖基化工程也许能够实现调控机制所要求的多数糖基化的标准化。选择性表达系统如昆虫细胞和酵母细胞产生糖基化的模式不同于哺乳类表达系统。酵母的高露糖糖基化通过将寡糖结合到巨噬细胞甘露糖受体来减少半衰期，从而导致抗体的降解。此外，产生于植物的糖蛋白的海藻糖和二甲苯是有毒的。相比之下，抗体糖链异质体唾液酸含量高可以延长

37、循环周期。与表达(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶的中国仓鼠卵巢细胞工程相似，毕赤酵母的内源酵母糖基化途径已经被替换为体内合成的糖基化途径包括真核生物的甘露糖酶I和II以及N-乙酰葡糖胺转移酶I和II。这种修饰允许带有相同复杂N-糖基化人类糖蛋白的产生。近期，大肠杆菌已成功的进行糖工程化。具有增强性血清半衰期的治疗性抗体的生产发展很有前景。 10.4.1.3 抗体大小和亲和力 基于抗体治疗的方法其指导杀死肿瘤细胞是凭借将抗原结合到抗体表面。因此，为了根除肿瘤中所有的细胞，抗体必须穿透肿瘤，远离血管系统的渗出物位点。肿瘤的特性是具有有孔的血管系统和水分无法渗出的淋巴管。这二者使得肿瘤产生高强度间隙

38、压力。在从血管外渗的大分子中，这种压力被作为以与分子量的立方根成反比的方式阻止他们扩散至肿瘤中。此外，目标抗原在肿瘤细胞中是高效表达的。Weinstein和他的同事假设脉管系统周边的高水平抗原将会作为抗体扩散的结合位点障碍物。Wittrup和他的同事扩展这种结合位点障碍物模型来解释抗体的内化和分解代谢，一旦他们将抗原吸引到细胞表面。如以上详细说明，免疫球蛋白G单克隆抗体的药代动力学行为使他们成为对基于抗体疗法的有利结构。然而，治疗免疫球蛋白G的大面积和高功能性的亲和力被预测会恶化压力梯度和结合位点屏障，从而限制这些抗原渗透肿瘤的能力。当耦合异构抗原的表达，这些影响可能解释不均匀分布系统性管理抗

39、体,这些抗体可以在肿瘤块的活检样本中观察到。虽然，工程抗体的大小和亲和性是独立的特征，当设计一个优化的治疗时他们必须结合起来评估。分子大小和亲和性之间的相互影响以及他们如何影响体内的行为是由Schmid等建模。抗体的大小和扩散至肿瘤速率之间的负相关已经导致预言抗体片段小于完整的免疫球蛋白对于扩散远离肿瘤脉管系统更有效。相反，这促使多种抗体类结构的肿瘤目标属性的创建和测试，其中一些可见于图10.5，如triabodies and tetrabodies已经构建。这些结构最简单的是25 kDa单链可变片段，由肽段连接的V Hand VL区组成。单一链作为构建块创建(scFv)2和双体也作为双功能单

40、一链抗体和BiTEs。额外的的结构没有在图10.5中展现，如已经构建的triabodies and tetrabodies。分子大小对肿瘤渗透的影响是通过一系列绑定到在LS174T人类结肠癌异种移植肿瘤相关糖蛋白72的工程抗体。这份研究数据与假设一致，肿瘤渗透性与抗体分子的大小无关。小于5065 kDa的抗体进行快速、初步的肾脏的清除。尽管scFv和(scFv)2预计会增加肿瘤渗透性与大的相对物相比，这些蛋白质快速的从循环中清除，限制肿瘤能被实现总的吸收水平。一系列的策略来规避首次通过的清除以及增加治疗单链抗体可变区基因片段的半衰期。PEG融合单链抗体可变区基因片段已经改善了抗体的稳定性和肿瘤

41、的靶向性而没有增加毒性。例如，结合PEG3400到anti-TAG-72双特异抗体或者anti-CEA的双特异抗体带来一个明显的分子大小的蛋白质复合物,等效于一个小型抗体,改善肿瘤肝比率。它被假定聚乙二醇化双体如这些，或者聚乙二醇化单链抗体可变区基因片段如4D5-PEG20可用于成像或细胞毒性的有效载荷的传递。 与免疫球蛋白G相似，血清中白蛋白的半寿期通过与FcRn的联系来调控的。许多研究策略被用来开发白蛋白作为一种延长scFv半衰期的机制。白蛋白基因融合的构建是一种方法。例如，一个抗癌胚抗原单链抗体可变区基因片段-白蛋白 融合蛋白质表明比裸scFv在肿瘤滞留时间提高了2.5倍。另外一个蛋白质

42、，MM-111，临床试验的双特异性anti-Her2/HER3 scFv-albumin融合蛋白也是使用这种方法。另一种策略使用绑定白蛋白的融合运用到治疗抗体上。这些包括多肽类，单区抗体，链状球菌G蛋白质区以及小分子。与白蛋白的非共价亲和性在这种方法可以量身定做,以调整PK和促进白蛋白抗体的离解来增强肿瘤渗透性。 当设计最佳治疗剂时，除了抗体大小还应考虑抗体对目标抗原的亲和性。对目标抗原的亲和性既要能够支持肿瘤的靶向性也能给予期望的生物学效应。相似于抗体的人源化，许多有效的技术用来发展亲和成熟抗体分子。许多基于显示技术,如噬菌体和酵母显示,涉及创建一个“二次”图书馆通过多样化的V基因,和然后选

43、择和筛选高亲和力变体。抗体亲和性的进一步完善可通过CDR-directed 模式方法，在这章抗体人源化的部分讨论过。亚当斯等人已经显示,使用一组抗-HER2/neu scFv 其亲和力范围是从1.6×106M到1.5×1011M，最高的亲和力的抗体可能事实上是次优的靶向抗肿瘤。与定位障碍物的假设一致，作者发现低亲和scFv分布式扩散地穿过在24小时内注射后的肿瘤血管区域。具有10,000高亲和力的scFv只能在血管中细胞直径减小时检测到。低亲和抗-EGFR单克隆抗体尼妥珠单抗和西妥昔单抗或者帕尼单抗之间的比较突出了亲和力在临床上的重要性。10.4.2 提高抗体的效应功能 相

44、似于病原体的调理素作用，将治疗抗体结合到肿瘤细胞的表面有可能通过Fc依赖性与 Fc受体相互作用来指导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性对肿瘤的抵抗，其Fc受体发现于免疫细胞的表面。同样,结合肿瘤的免疫球蛋白可以通过互补依赖细胞毒性杀死肿瘤细胞。这些过程可在图10.3a中可见。一些治疗性单克隆抗体在临床上的成功归功于诱导ADCC和CDC的能力或者两者兼有。免疫球蛋白G片段的选择、Fc工程和新颖的免疫抗体类似结构为增加抗肿瘤免疫应答的效应性体供了方法。10.4.2.1 免疫球蛋白G同型物无论是设计治疗嵌合抗体还是人类抗体Fc区域免疫球蛋白G同型物很重要，因为它以最直接的方式调控ADCC和CDC。免疫球蛋

45、白G同型物与Fc区域有95%的同源性，但不同于氨基酸组成和铰链区结构。免疫球蛋白G1是一种最常见的被用来作为治疗性抗体的片段，因为它发挥了ADCC和CDC的最大作用。免疫球蛋白G3也能增强CDC的功能甚至超过免疫球蛋白G1，但他们很少使用因为他们的铰链区更容易发生蛋白质水解作用。The 免疫球蛋白G2对Fc受体和互补串联C1q 的亲和力低，因此不能有效地诱导ADCC或CDC。当使用抗体将细胞毒性药物携带至肿瘤，或者当抗体对溶解性抗原的中和具有治疗作用或是不必要的，免疫球蛋白G2 同型物在刺激病人非必要免疫系统的情况下是有用的。免疫球蛋白G4同样被如此使用，然而它的半衰期比免疫球蛋白G1小两倍。

46、10.4.2.2 通过突变改变与Fc受体相互作用FcR家族由3个类型组成并能进一步划分子类。FcRI 对免疫球蛋白G的亲和力高于FcRII或者FcRIII。信号传输是通过类型 I, IIa, and IIIa 受体效应细胞和ADCC的激活，这归因于免疫受体酪氨酸相关的激活基序。类型IIb 受体的信号传输通过免疫受体酪氨酸相关的激活基序抑制细胞的激活。很大的努力都集中在修饰免疫球蛋白G的Fc域以优化对诱导 ADCC FcR子类的参与。FcR与免疫球蛋白发生作用的主要位点在Fc CH2 和铰链区。希尔兹等人发现几个能增加对FcR IIIa亲和力普通的Fc免疫球蛋白g结构的突变体，但不影响或降低对

47、IIb的亲和力。最近，结合计算药物蛋白设计方法加上高通量筛选的方法已经发现突变体，这些突变体提高耦合两个临床相关抗体的能力， 抗CD52 抗体阿仑单抗和抗HER2抗体曲妥珠单抗。针对CD-30 and CD-19的抗体已经产生，这已经用于治疗霍奇金淋巴瘤或者渐变性大细胞型淋巴瘤的临床试验。特异性结合碳水化合物部分的Fc残基的修饰也能够调节FcR的识别。将 C1q结合到抗体的Fc区域是激活CDC的第一步，级联反应依赖于第一步的强度。因此研究者同过促进C1q的结合观察渐增的CDC。这可由改变Fc CH2的残基或者抗体的铰链区来实现。使用一种专有的方法，这种方法基于将IgG3同型物的内在补体结合活性

48、传递给一个IgG1骨架，Natsume等人证明工程抗CD20表现出比亲本 IgG1 抗体更强的CDC活性，而不改变其ADCC属性。10.4.2.4 双功能抗体与T细胞双特异性单链抗体BiTE 要增强感受器的功能可以通过对mAbs的Fc区域进行修饰，另一个方法是通过创建双功能抗体来识别肿瘤相关抗原和“触发抗原”或者在免疫感受细胞表面的受体。(Figs. 10.3 and 10.5)。两个抗原同时参与可以改变效应细胞对肿瘤产生的细胞毒性的潜能。(Weineretal.,1993,Keleretal., 1997).在使免疫系统恢复健康方面，双功能抗体比单克隆抗体有优势。首先，双功能抗体的选择和亲和

49、力的成熟可以通过细菌和酵母表面显示的方法，（就像在人类抗体的选择那里讨论的一样），可以根据配对的受体细胞的特点对双功能抗体进行定向剪切。第二点，双功能抗体可以选择性的和FcR的表位连接，有别于FcR与Fc结合时涉及的表位。这样就可以如期望一样在体内补充IgG过量的条件下感受器的功能，(Weineretal., 1993)。第三，bsAb对肿瘤的目标的特异性可以用来指导免疫效应细胞肿瘤细胞毒性的潜能，包括T细胞，这些都是IgG分子平常无法达到的。 双特异性单链抗体BiTE作为一个特异的招募T细胞用于癌症治疗的多功能平台，BiTE激活的T细胞可以通过释放穿孔素使细胞膜穿孔，从而使颗粒酶B释放，引起

50、细胞凋亡从而杀死细胞。有一些进入临床前和临床研究的BiTE展示出美好的前景。研究表明因KRAS和BRAF致癌基因突变引起的结肠直肠癌对西妥昔单抗具有抗性，而以EGFR为靶标的BiTE在体内和体外都表现出抵抗这种结肠直肠癌细胞的活性。同时，一种叫MEDI-565的BiTE可以在结肠直肠癌病人进行化疗治疗前使用，因为它以癌胚抗原和CD3为靶标，可以使病人体内的T细胞对癌细胞进行攻击。Blinatumomab,一种针对CD19/CD3的BiTE，现在在进行用于针对病人的复发性的非霍奇金氏淋巴癌的临床试验。MT110，一种以EpCAM/CD3为靶标的对抗晚期肺癌和胃肠道肿瘤的BiTE亦进入了临床试验。

51、双功能抗体和BiTE抗体会在本卷第12章有更加详细的论述。10.4.3 多克隆抗体疗法 如上所述，多克隆抗体的制备可以从经免疫的动物的血清中分离所得，然而，低效和安全问题很大程度上限制了它的使用。人们猜测在体外，抗原特异性的多克隆抗体合剂在对抗同一种抗原会比标准的单克隆抗体为基础的治疗更为有效。因为免疫系统在受到抗原入侵时一般形成多抗体反应，以多克隆抗体为基础的治疗可以通过招募效应细胞杀死癌细胞。此外，多克隆抗体比单克隆抗体更加有效地清除肿瘤细胞微环境中活化的配体，或者使细胞表面受体去活化。重组抗体技术的出现证明了这一猜测是正确的。 原则上，体外多克隆抗体治疗可以通过从标准技术中单独表达和纯化

52、出来的单克隆抗体混合或联合使用达到。临床试验会根据目前使用的标准的联合治疗方案。这一方案一直被用于抗HER2（原癌基因人类表皮生长因子受体2）单克隆抗体曲妥珠单抗和使用pertuzumab（帕妥珠单抗），而且获得了比较理想的结果。患有转移性乳腺癌的病人进行了曲妥珠单抗治疗后的客观有效率为24.2%，二期的临床受益率为50%。Nielsen等人提出了一个使用多克隆抗体治疗的可行的方法，如Fig. 10.6a, d, e. 这个方法是建立在Sympress技术的基础上的，据报道说，它允许由多达六个不同的IgG抗体制造出具有成本效益的单批量的pAb。这种方法在细胞工程方面存在很多很变化，这可能是因为

53、在产品的生产增长或表达存在着特性变化。这些问题得到了解决，部分原因在于通过制定一个涉及多克隆抗体库和多克隆工作细胞库的多阶段生产计划，先分别冷冻然后稳定混合可以稳定地产生抗体的细胞系。这种方法经临床批准目前已经投入使用。10.5 治疗性抗体的包装 大多数FDA批准的mAbs的功能都是通过固定的作用机制。通过与目标抗原结合，他们要么改变了受体介导的信号转导通路，推动肿瘤的发生和发展，或者导致肿瘤细胞被免疫系统杀死，然而，缺乏固有的抗癌活性的mAbs仍然可以被用作运载细胞毒素的运载体，如化疗，放疗，毒素，细胞因子。这类以mAbs为基础的药物设计过程中就需要考虑使用更多的mAbs。10.5.1 免疫

54、药物化合物 Gemtuzumab ozogamicin是一种人源的IgG4抗CD33抗体，它与细胞毒性的抗生素共轭结合。它用于复发性的CD33阳性的急性髓性白血病，也是目前为止唯一一种FDA认可的免疫化合药物。虽然数据的安全性最近遭到了质疑，但是Gemtuzumab ozogamicin为免疫化合药物的迅速发展奠定了基础。支持这一领域发展的猜想是mAb的肿瘤的靶标性可以制备出放疗治疗时把细胞毒性作用集中与肿瘤的抗癌制剂，而对全身的使用时不至于太具毒性。卡里奇霉素（Calicheamicin）和maytansinoid衍生物是目前为止临床认可的两类放疗药物。Trastuzumab-DM1代表了这类扩展性的癌症治疗。它在进行HER2阳性乳腺癌系列二期试验中表现出了强大的单药活性，推动了以HER2为靶标的癌症治疗。 化学上过去一直设计连接物将细胞毒素与m