血细胞分析仪的溯源及国际参考方法

1、作者单位:日本神户市西区高琢台日本SYSMEX株式会社学术部国际学术交流血细胞分析仪的溯源及国际参考方法藤本敬二为加强对血细胞分析仪的溯源及国际参考方法了解,作者主要对血细胞计数分析(红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、血红蛋白以及红细胞压积的国际参考方法建立的过程和及其概要进行了阐述,并对国际参考方法与各实验室目前方法学的溯源性进行了论述。在具体工作流程上,对使用人新鲜血或经过了稳定固化加工的血细胞确立检验结果溯源性方法及其注意事项进行了介绍,同时论述了室间质控和室内质控的重要性。1.血细胞分析和国际血液学标准化委员会的历史:血细胞计数是临床检查中最基本最重要的项目,检测内容包括红细胞,白细

2、胞和血小板等血细胞计数项目以及血红蛋白浓度的测定。血细胞计数最初是使用显微镜对显微镜视野内的各种细胞以人工目视的方法进行计数,但是,1953年Coulter公司的创始人,W1H1Cloulter成功的研制出世界第一台自动“流体中悬浮颗粒分析仪”之后1,2,经过不断的技术革新,其自动化技术逐步应用于血细胞分析仪中。另外,作为一种简便的检测血液中红细胞浓度的方法,可将全血放入试管中,经过离心分离后测量沉淀的红细胞体积与样品体积的比例,即所谓的红细胞压积(Packed Cell Volume,PVC。现在,红细胞压积的检测也已经成为自动血细胞分析仪的检测指标之一。红细胞中的血红蛋白具有输送氧气功能,

3、其定量检测最初使用试管进行检测的,现在该方法也已经实现自动化,已成为自动血细胞分析的指标之一。这类可实现血细胞分析自动化的装置通常被称之为血细胞分析仪或Hematology Analyzer,最初在欧洲和北美被迅速普及。1963年,在欧洲血液学会里斯本会议(葡萄牙上,召开了题为“血细胞分析技术及其标准化”的研讨会,大家发现,被认为是比显微镜检查准确度高的各种自动血细胞分析仪的检测结果大相径庭(室间差异,为了解决这个问题,大会设立了国际血液学标准化委员会(International Council for Standardization in Haematology。其中的血红蛋白检测专家组和血

4、液细胞分析专家组一直在展开各种活动,致力于确立血红蛋白检测的国际参考方法和血液细胞分析的国际参考方法。2002年末,血细胞分析的基本指标红细胞、白细胞、血小板分析及血红蛋白浓度以及PCV检测的国际参考方法都已确立。2.血细胞分析(红细胞、白细胞、血小板国际参考方法概略:红细胞和白细胞的国际参考方法制定于1994年3。检测系统中的所有血液流路部分都采用加工后多年不会变形的石英玻璃部件,定量部使用水银压力计。为了最大程度减少流体检测中的误差,设计尽可能简单,检测原理为电阻法。根据检验原理,需要对全血样品进行数万倍的稀释,为了最大程度减少稀释过程中的误差,要使用A级的精密烧瓶和精密吸管。仪器对同时通

5、过检测部位的细胞不具有修正功能,但可对一系列不同稀释比例的标本进行校准。利用不同浓度的标本同时通过检测部位的细胞数的比例不同的原理,以连续稀释的检测结果计算出无限稀释倍率浓度时的检测结果(在该浓度下,可认为没有细胞同时通过检测部,并将该结果确定为所测标本的“真值”。血小板的国际参考方法于2001年4确定。在此之前曾对各种方法经过长期的讨论,由于各种方法各有优劣都没有得到通过,新的参考方法是采用流式细胞术以单克隆抗体(CD41和CD61对全血进行识别,得到红细胞总数和血小板总数的比率。再根据血小板和红细胞的比率,乘以红细胞参考方法所检测得到的红细胞真值来间接计算出血小板的真值。3.血红蛋白的定量

6、和PCV国际参考方法简介:血红蛋白的定量是血细胞分析项目之中最早确立国际参考方法的指标,随后又进行过多次改定5。检测时使用商品化的分光光度计,采用氰化高铁血红蛋白法进行检测。检测结果的准确度除了取决于分光光度计的质量,还有赖于检测所用的石英比色杯的精度,标本的稀释精度,以及是否根据参考方法中的规定对试剂进行调整,是否按照规定使用清洁的过滤网对标本进行测试前的过滤等。在过去,实验室中一直以精密毛细管法作为PCV的参考方法6,但是由于精密毛细管的一端需要封入黏土(seal,而且精密毛细管中血液各组分的交界部分不清晰或不均一,造成红细胞的沉积部分越到下方越容易因为压缩过度而脱水变形,越往上越容易混入

7、白细胞,血小板或血浆(trapped plasma,所以,人们一直在探讨可以代替精密毛细管法的新方法,2001年新的参考方法确立了7。该法同精密毛细管法相比,从开始操作开始到往精密毛细管内吸入红细胞的步骤是相同的,但是计算时却慎重地避开了精密毛细管的上部和下部仅取中央部分,通过国际参考方法测定该部位的血红蛋白浓度。其结果与国际参考方法测得的全血的血红蛋白浓度的比率为PCV。只是这种测定方法在检验室里实际操作中还有很多困难,所以,目前正在讨论更具有可行性的适用于检验室的参考方法。41血细胞分析结果的溯源性:如上所述,由于确立了血细胞分析仪的基本检测指标红细胞,白细胞,血小板,血红蛋白,PCV 的

8、国际参考方法,一般医疗机构血细胞分析仪的检测结果在理论上可以溯源至国际参考方法(图1。 图1确保多实验室结果可溯源性的流程图 具体的操作流程是,首先使用国际参考方法对加入抗凝剂EDTA2K 的正常人新鲜血液进行检测,其结果作为该标本的各指标的真值。然后使用要校准的血细胞分析仪(下称检测系统,对同一标本进行检测,并对检测结果进行修正使其与国际参考方法的检测结果相同。此时,该检测系统(B 与国际参考方法具有可溯源性,即A =B 。但是,如果将某一区域内所有相同的检测系统(C 都使用上述的同一份新鲜健康人血液进行检测,并把检测结果修正到与国际参考方法一致,实际操作中会存在许多困难。为了解决这一问题,

9、可用已溯源到国际参考方法的检测系统(B 检测可以长期保存的固定后的血液,然后再用其他相同的检测系统(C 检测该样品,并把所得结果修正到与(B 相同,此时,市场上相同的检测系统便可以同与国际参考方法可溯源的仪器进行间接溯源,即B =C 。A =B ,B =C ,所以A =C ,从而使市场上的检测系统都可以与国际参考方法进行溯源。用C 在对其他检测系统D 进行溯源性校准时,可以假定C 为A ,如果两者之间使用新鲜健康人血液具有互换性的话,再用固化后的血液进行调整使C =D ,那么,A =B ,B =C ,C =D ,则A =D ,即D 也与国际参考方法具有可溯源性。进而再继续构筑一系列这样的流程,

10、就可以推进各国、各地域的标准化,最终实现各单位间检测结果的标准化。51标准化的目的及目前所存在的问题:按照上述方法,理论上可使所有的血细胞分析仪实现标准化,实现所有患者的检测结果达到标准化这一目标。但为实现这一目标需要有一个前提条件,就是所有的血细胞分析仪均使用上述方法与国际参考方法进行溯源。而目前的现状是,由于各厂家生产的血球分析仪采用的检测原理和试剂的性质不同,造成结果的潜在差异8,9。尤其对于一些特殊标本,在不同的检测系统中得到的数值有时会与真正的数值出现差异。为此,检测分析仪的生产厂家和经销商有责任向用户长期稳定地提供该检测系统的特殊标本检测结果及各种相关信息。而且为了能够长期地保持这

11、种可溯源性,需要客观上保证该溯源体系中的所有检测系统每年、每日、每时处于稳定状态。为此,各检测系统一旦进入溯源体系就都有必要积极地进行室内质控和室间质控。目前,中国卫生部临床检验中心和各省的临床检验中心正在共同努力构筑上述的溯源体系,笔者虽然力微,但也愿意为该事业贡献自己的一份力量,每当看到中国检验医学专家和有关人士对这项事业的高涨热情,极大地使命感引起我的思考,总能使我想起中国唐诗选第一首,魏徵的名诗述怀中的一节“人生感意气,巧名谁复论”的诗句。让我们共同努力促进溯源体系的构筑和完善。参考文献1Coulter WH.United states patent ,1953,20:26526508

12、.2Lewis SM.Harmonization and standardization of the blood count 2the role of the ICSH cytometry panel 2,Sysmex J Int ,1999,9:127.3ICSH Cytometry Panel :Reference method for the enumeration of erythrocytes and lucocytes ,Clin lab Haemat ,1994,16,1312138.4ICSH Cytometry Panel.Platelet counting by the

13、RBC/patelet Ratio Method 2A reference Method 2.Am J Clin Pathol ,2001,115,4602464.5ICSH HG B Expert Panel.Recommendation for reference method for haemoglobinometry in human blood and specifications for international haemiglobincyanide standard.J Clin Pathol ,1996,49,2712274.6NCCLS :Procedure for determining facked cell volume by the microhematocrit 2000.NCCLS Publication H72A3.7ICSH Cytometry Panel.Recommendation for Reference method for the packed cell volume.Lab Hematol ,2001,7:1482170.8Cornbleet J.Spurious results from automated hematology cell