脉冲电磁场结合碱性成纤维细胞生长因子促进软骨修复的实验研究

1、脉冲电磁场结合碱性成纤维细胞生长因子促进软骨修复的实验研究                        作者：胡小鹏，陶海荣，许志兴，金文杰，傅智轶，丁欢 【摘要】  研究脉冲电磁场结合碱性成纤维细胞生长因子促进关节软骨修复的作用机制。40只新西兰大白兔，随机分成4组，每组10只。在双侧股骨髁关节面制成直径为0.6 cm、深0.3 cm的软骨缺损

2、，分别以bFGF、磁场、磁场结合bFGF，另外一组为空白组未给予治疗。分别于术后4、8、12和16周取材，行大体形态观察、组织学检查和透射电镜检查，并进行统计学处理。结果表明：磁场结合bFGF组在4周时基底层的软骨样组织增生，而磁场组、bFGF组少量软骨样组织增生。8、12周结合组透明样软骨层明显增厚，免疫组化型胶原多。而磁场组、bFGF组软骨层增厚，细胞数量相对少，无型胶原。空白组偶见软骨样组织或纤维组织。16周结合组软骨层与正常软骨相似，软骨细胞成熟，bFGF、磁场组纤维软骨细胞团状增生。改良的软骨缺损修复Wakitani评分有显著性差异，结合组最大。说明低能量脉冲电磁场结合碱性成纤维细胞

3、生长因子修复软骨缺损，治疗方法简便，效果良好，可应用于临床。 【关键词】  脉冲电磁场；碱性成纤维细胞生长因子；软骨缺损；修复    Abstract：To study mechanism of the cartilage repair with pulsed electromagnetical fields combined with b-fibral  growth factor.40 New Zealand white rabbits were devided into 4 groups   as bFGF group

4、,magnetic group, pulsed electromagnetical fields combined with b-fibral  growth factor group and  nontreatment group randomly. The animals were sacrificed at 4、8、12 and 16 weeks after treatment. The specimens were examined with the gross, histological and TEM evaluation . Results showed th

5、at four weeks after treatment,cartilage-like tissue grew at the bottom. The cartilage of germinative layer and basal layer grew better than that in bFGF group, magnetic group. Chondrocytes grew better and secreted collagen , while the cartilage like tissue proliferated less. At 8 and 12 weeks, fibro

6、us cartilage in combined group was thicker than that in other groups, and the cells were larger and muturer and more collagen .At 16 weeks, the cartilage was similar to normal one. The chondrocytes were muturer. Wakitani score of  cartilage repair was significantly different in all groups, it w

7、as better in the combined group at 16 weeks.Cartilage repairing defects with pulsed electromagnetical fields combined with b-fibral  growth factor is a promising method. It can be used in clinic in the future.    Key words：Pulsed electromagnetical fields；B-fibral growth factor；Ca

8、rtilage defect repair    由创伤和退行性病变引起的骨关节炎是临床常见的疾病，其治疗是临床的难题之一。常见的治疗方法有钻孔术、微骨折、骨膜和软骨膜移植、细胞移植、骨软骨移植等。其结果是纤维软骨修复或透明样软骨修复，很快退变，治疗效果不理想1。利用细胞生长因子、基因转染等2促进软骨修复是近年来软骨组织工程研究的热点。我们用低强度脉冲电磁场结合碱性成纤维细胞生长因子治疗软骨缺损，取得较好疗效。现报告如下。    1  材料与方法    40只新西兰大白兔，平均体重2.4 Kg（

9、2.22.5 Kg），随机分成4组，每组10只。分为磁场结合bFGF组、bFGF组、磁场组和空白对照组。以30 mg/kg戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉。麻醉后剪毛、消毒、铺巾，取双侧膝关节正中切口，切开2 cm的皮肤，切开深筋膜，髌骨内侧切开关节囊，暴露股骨内外侧髁，在双侧股骨髁关节面分别制成直径为0.6 cm,深0.3 cm的软骨缺损。bFGF组双侧膝关节腔内每周注入bFGF 10 ug一次，连续三周。磁场组每天给予低能量脉冲电磁场（3000高斯，50 Hz）刺激6 h， 磁场结合bFGF组给予bFGF注射和低能量脉冲电磁场，空白组软骨缺损模型制成后不做任何处理。术后青霉素钾(单位40万)肌内注射

10、三天。  1.1  观察指标    1.2  统计学方法    采用SPSS11.0软件包处理，各组数据进行改良的软骨缺损修复Wakitani评分，ANOVA进行分析。 样本用均数±标准差表示。    2  结果    2.1  大体标本    4周时磁场结合bFGF组乳白色的纤维软骨样组织覆盖，新生的软骨未完全填平缺损。磁场组乳白色纤维样组织覆盖，量少。bFGF组纤维组织填充，淡黄色或

11、白色。空白对照组仍无组织填充。8周时磁场结合bFGF组新生软骨增生明显，低于软骨面（见图1）。磁场组、bFGF组软骨样组织增多。空白对照组少数有纤维组织充填，缺损旁边的软骨有变性破坏。12周磁场结合bFGF组新生软骨饱满外，形态和颜色与正常软骨相似。bFGF组少量软骨样组织增生。空白组有纤维组织增生。16周磁场结合bFGF组软骨进一步成熟，新生软骨略平或向表面隆起,与正常软骨相似（见图2）。空白组骨质增生，周围软骨有磨损，有破坏。    2.2  HE染色和免疫组织学检查    4周时，HE染色磁场结合bFGF组基底软骨样细

12、胞和纤维细胞，少量陷窝内的细胞存在纤维组织（见图3）。磁场组和bFGF组可见少量的基底软骨样细胞和纤维细胞。空白组无软骨和纤维生长。8周时磁场结合bFGF组软骨层明显增厚，有软骨岛，细胞体积大，数量多。软骨基底层和生发层均良好（见图4），可见 型胶原。磁场和bFGF组以纤维细胞为主，偶见软骨岛。12周时磁场结合bFGF组表层细胞生长良好（见图5）。而bFGF组和磁场组可见大量的纤维组织，bFGF组有软骨样细胞。空白组有大量的纤维细胞。16周时磁场结合bFGF组软骨层与正常软骨相似，细胞排列成柱状（见图6）。免疫组化显示型胶原进一步增多(见图7)，bFGF、磁场组均有纤维软骨细胞团状增生，空白组

13、细胞相对少，以成纤维细胞为主，少量的软骨样细胞。    2.3  电镜检查    电镜检查4周后，结合组软骨和纤维细胞增多，软骨细胞内溶酶体较丰富,细胞线粒体、内质网等细胞器多(见图8)。bFGF组、磁场组细胞表现较为幼稚，细胞内线粒体、内质网等细胞器较少，细胞周围胶原纤维均较少(见图9)。空白组未见软骨细胞。    (×10 000)12周时结合组软骨细胞内线粒体和粗面内质网较多，空白组有少量纤维软骨细胞。    第16周时结合组与磁场组、bFGF 组，

14、单因素方法分析，方差齐性，各参数组两两相比较，结合组在细胞形态、基质染色表、新生软骨平均厚度与周围结合度均高于其他组，有差异性，表面光滑度无差异性。bFGF组和磁场组除新生软骨厚度外其余均无差异性。空白组各指标除表面光滑度外明显低于其他组。    3  讨论    正常关节软骨为白色、透明、光滑、边缘规则整齐、富有弹性透明组织，由软骨细胞，基质和纤维组织构成。软骨无血管神经和淋巴组织，由于软骨细胞几乎没有迁移能力，不能迅速聚集到创伤部位所致3。所以自身修复比较困难。修复的组织为纤维软骨而非透明软骨，缺乏正常透明软骨的耐用性及

15、特有力学功能，缺乏组织学、生化和生物力学等方面的特性。组织工程修复软骨缺损存在的问题是目前还没有一种完全合适的种子细胞-，软骨容表  第16周软骨缺损修复Wakitani评分易退变。单纯生长因子修复软骨缺损尚未成熟，其应用在临床上仍然受到许多因素的制约6。1             bFGF是一种具有广泛生物活性的肽类物质，纯化的bFGF是一条单肽链，在生理条件下由140个氨基酸构成，分子量约14 kD。它普遍存在于多种器官组织中，主要在细胞和细胞外基质。刘晓阳等7通过实验研

16、究发现，bFGF可加速mRNA转录、蛋白质合成及各种细胞器组装，从而加速软骨细胞有丝分裂过程，刺激软骨细胞增殖并促使其分化，在体外培养中可促使分化中的软骨细胞发生迁移和形成集落，促进体外前体软骨细胞分化、软骨细胞增殖成熟及细胞合成基质，是一种强大的软骨细胞有丝分裂原8。    本课题以6 mm直径的关节软骨缺损，空白组以纤维组织和少量的软骨样细胞修复为主，而注射bFGF组8周和12周有软骨样和纤维软骨细胞增生。说明bFGF促进软骨细胞分化与增生，与Nlizuta等9研究结果相一致，但无型胶原纤维形成，说明单纯注射bFGF不能促进透明软骨细胞的形成，缺损的修复仍然是

17、纤维软骨细胞增生。可见，单纯关节腔内注射FGF达不到修复的要求。    低能量脉冲电磁场已有广泛的临床应用，用以加速骨折愈合或骨折延迟愈合及严重粉碎骨折。低能量脉冲电磁场治疗颈椎和膝关节炎退行性变，取得了较好的疗效。Mizuta 等10在双盲34例膝关节骨关节炎利用低能量脉冲电磁场治疗，发现治疗组Womac骨关节炎指数明显减少，快速行步的步速和步长明显增加，等长收缩时间缩短，能提高膝关节的功能。但对于治疗机制尚未明确。低能量脉冲电磁场在体外能促进软骨细胞的代谢，并促进软骨细胞增殖。Deborah等11研究发现，低能量脉冲电磁场加强软骨细胞的分化和成熟，促进软骨细胞

18、分泌蛋白糖原和葡萄糖氨基多糖的合成，发现型胶原mRNA的高表达。Mattei等12研究发现低能量脉冲电磁场促进低浓度软骨细胞体外增殖。Fioravanti等13研究发现低能量脉冲电磁场抑制IL-1产生而抑制软骨的降解。但本实验应用低能量脉冲电磁场不能获得高质量的软骨组织，也未获得型胶原纤维。单纯应用bFGF或单纯应用低能量脉冲电磁场均不能获得高质量的软骨组织。而本实验两者联合应用后发现，4周时基底软骨样细胞增生，8周时软骨层明显增厚，有软骨岛，细胞体积大，数量多。软骨基底层和生发层均良好，并出现型胶原，16周时胶原进一步增多。所以可能两者有协同作用，产生了透明软骨，且软骨细胞功能良好，分泌型胶

19、原数量多。透明软骨细胞可能是来源于缺损旁边软骨膜的软骨祖细胞，受磁场和bFGF刺激后迁移过来，并进一步分化为透明软骨细胞。其迁移及分化机制有待于进一步研究。或有可能软骨样细胞在磁场和bFGF刺激下分化为透明软骨细胞。12周结合组除新生软骨饱满外，形态和颜色与正常软骨相似。实验组软骨缺损周围未见明显的骨质增生。可能与低能量脉冲电磁场抑制IL-1，TGF产生等有关。    低能量脉冲电磁场操作简单，而bFGF来源方便。两者均无明显的副作用，治疗方法简便，对软骨修复作用效果良好。【】  1O' Driscell S W,Kelly F W ,Salte

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