第八章高效液相色谱分析

1、生物工业分析生物工业分析第八章高效液相色谱法第八章高效液相色谱法 教学目的与要求教学目的与要求 掌握高效液相色谱分析的原理；掌握高效液相色谱分析的原理；熟悉高效液相色谱分析的操作条件熟悉高效液相色谱分析的操作条件 教学重点与难点教学重点与难点 理解掌握高效液相色谱分析的理解掌握高效液相色谱分析的原理和操作条件的选择原理和操作条件的选择 教学方法教学方法 课堂讲授与自学相结合课堂讲授与自学相结合 教学内容教学内容 第一节第一节 概述概述 1.1 高效液相色谱法分类：高效液相色谱法分类： 依据依据分离机理的不同分离机理的不同，主要分为五类：，主要分为五类： 分配色谱：分配色谱： 吸附色谱：吸附色谱

2、： 离子交换色谱：离子交换色谱： 体积排阻色谱：体积排阻色谱： 亲和色谱：亲和色谱： 依据使用的依据使用的固定相和流动相相对极性的大小不同固定相和流动相相对极性的大小不同，分为：，分为： 正相色谱正相色谱：流动相极性小于固定相极性：流动相极性小于固定相极性 反相色谱反相色谱：流动相极性大于于固定相极性：流动相极性大于于固定相极性凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱 1.2 高效液相色谱法特点：高效液相色谱法特点： 高效高效: 高压高压: 高速高速: 高灵敏度：高灵敏度： 1.3 方法的局限性：方法的局限性： 分析成本高于气相色谱法，且易引起环境污染分析成本高于气相色谱法，且易引起环

3、境污染 不能完全替代气相色谱法，无法达到柱效高达不能完全替代气相色谱法，无法达到柱效高达10万块理论万块理论塔板数以上的要求塔板数以上的要求 不能完全代替中、低压柱色谱法不能完全代替中、低压柱色谱法 1.4 高效液相色谱法与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法的比较 表表8-1 高效液相色谱法与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法的比较项目项目高效液相色谱法高效液相色谱法气相色谱法气相色谱法应用应用范围范围可分析低分子量、低沸点样品；高可分析低分子量、低沸点样品；高沸点、高分子有机物；离子型无机沸点、高分子有机物；离子型无机化合物；热不稳定，具有生物活性化合物；热不稳定，具有生物活

4、性的生物样品的生物样品可分析低分子量、低沸点有机化可分析低分子量、低沸点有机化合物；永久性气体；配合程序升合物；永久性气体；配合程序升温可分析高沸点有机化合物；配温可分析高沸点有机化合物；配合裂解技术可分析高聚物合裂解技术可分析高聚物仪器仪器组成组成要求要求溶质在液相的扩散系数很小，故在溶质在液相的扩散系数很小，故在色谱柱以外的死空间应尽量小，以色谱柱以外的死空间应尽量小，以减少柱外效应对分离效果的影响减少柱外效应对分离效果的影响溶质在气相的扩散系数大，故柱溶质在气相的扩散系数大，故柱外效应的影响小，对毛细管气相外效应的影响小，对毛细管气相色谱应尽量减小柱外效应对分离色谱应尽量减小柱外效应对分

5、离效果的影响效果的影响流动流动相相1 1 流动相可为离子型、极性、非极流动相可为离子型、极性、非极性、弱极性溶液，可与被分析样品性、弱极性溶液，可与被分析样品产生相互作用，并能改善分离的选产生相互作用，并能改善分离的选择性；择性； 2 2 液体流动相动力粘度为液体流动相动力粘度为1010-3 -3 PaPas s，输送流动相压力高达，输送流动相压力高达2-20MPa2-20MPa1 1 气体流动相为惰性气体，不与气体流动相为惰性气体，不与被分析的样品发生相互作用；被分析的样品发生相互作用；2 2 气体流动相粘度为气体流动相粘度为1010-5 -5 PaPas s，输送流动相压力仅为输送流动相压

6、力仅为0.1-0.5MPa0.1-0.5MPa检测器检测器选择性检测器：选择性检测器：UVD、PDAD、FD、ECD通用型检测器：通用型检测器：ELSD、RID选择性检测器：选择性检测器：NPD、FPD、ECD 通用型检测器：通用型检测器：TCD、FID固定相固定相分离机理：可依据吸分离机理：可依据吸附、分配、筛析、离附、分配、筛析、离子子交换、亲和等多种原交换、亲和等多种原理理进行样品分离，可供进行样品分离，可供选选用的固定相种类繁多用的固定相种类繁多 2.色谱柱：固定相粒度色谱柱：固定相粒度小小，为，为5-10um；填充柱；填充柱内内径径3-6mm，柱长，柱长10-25cm ,柱效柱效10

7、3-104；毛细管；毛细管内内径径0.01-0.03mm，柱长，柱长5-10m，柱效，柱效104-105；柱；柱温为常温温为常温1. 分离机理：可依据吸附、分离机理：可依据吸附、分配、两种原理进行样品分分配、两种原理进行样品分离，可供选用的固定相种类离，可供选用的固定相种类较多较多 2.色谱柱：固定相粒度大，色谱柱：固定相粒度大，为为0.1-0.5mm；填充柱内径；填充柱内径1-4mm，柱长，柱长1-4m,柱效柱效102-103；毛细管内径；毛细管内径0.1-0.3mm，柱长，柱长10-100m，柱效，柱效103-104；柱温为常温至；柱温为常温至300高效液相色谱分析高效液相色谱分析 第二节

8、基本原理第二节基本原理一、液相色谱过程一、液相色谱过程 1 1流程图流程图 高效液相色谱的流程如图高效液相色谱的流程如图8-18-1所示。高压泵输送流动相和所示。高压泵输送流动相和试样组分高速流过色谱分离柱试样组分高速流过色谱分离柱时，具有时，具有不同分配系数不同分配系数的组分的组分在两相间经过反复多次的分配在两相间经过反复多次的分配平衡时被分离，通过检测器时平衡时被分离，通过检测器时被检测并给出信号。被检测并给出信号。 高压泵是高效液相色谱的动力高压泵是高效液相色谱的动力源，用来使液体流动相高速通过色源，用来使液体流动相高速通过色谱分离柱以达到快速分析的目的。谱分离柱以达到快速分析的目的。在

9、高效液相色谱中，通常使用往在高效液相色谱中，通常使用往复复式柱塞泵。式柱塞泵。进样装置：注射器，六通阀，自动进样装置：注射器，六通阀，自动进样器进样器梯度淋洗梯度淋洗就是流动相中含有就是流动相中含有两种或多种不同极性的溶剂两种或多种不同极性的溶剂，在，在分离过程中按一定程序连续分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性改变流动相中溶剂的配比和极性，使使被分离组分在两相中的被分离组分在两相中的分配系数改变分配系数改变，达到，达到提高分离效果，调节提高分离效果，调节出峰时间出峰时间的目的。两种方式来实现：的目的。两种方式来实现：外梯度外梯度（也称低压梯度）和（也称低压梯度）和内梯度内梯度

10、（也称高压梯度），外梯度是在常压下，按一定程序将溶（也称高压梯度），外梯度是在常压下，按一定程序将溶剂混合后再通过高压泵输入色谱柱；内梯度是利用两台高压输液剂混合后再通过高压泵输入色谱柱；内梯度是利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。后进入色谱柱。 高效液相色谱的分离柱具有很高的柱效，理高效液相色谱的分离柱具有很高的柱效，理论塔板数达每米论塔板数达每米3万。柱体为直型不锈钢管，标万。柱体为直型不锈钢管，标准填充柱内径为准填充柱内径为3.9或或4.6mm，柱长柱长1015cm，填料粒度填料粒度

11、5-10um时柱效可达时柱效可达5000-10000块块/m的理的理论塔板数。液相色谱柱的发展趋势是论塔板数。液相色谱柱的发展趋势是减小填料粒减小填料粒度和柱径以提高柱效度和柱径以提高柱效，因此柱较短。，因此柱较短。高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器：紫外吸收检测器紫外吸收检测器(UVD)：应用最广泛的检测器：应用最广泛的检测器，对流量和温度对流量和温度的波动不敏感的波动不敏感，可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱。只能检测有紫外吸收的物质。只能检测有紫外吸收的物质 电导检测器电导检测器(ECD)：选择性检测器，用于检测阴、阳离子。：选择性检测器，用于检测阴、阳离子。折射率检测器（折射率检测器（RI

12、D,又称差示折光检测器）又称差示折光检测器），通用型检测器通用型检测器，对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 荧光检测器荧光检测器(FD):高灵敏度选择检测，不宜作为一般的检测器使高灵敏度选择检测，不宜作为一般的检测器使用。用。 化学发光检测器化学发光检测器(CD)：是一种高灵敏度的检测器。：是一种高灵敏度的检测器。 蒸发散射光检测器（蒸发散射光检测器（ELSD）：是一种通用型检测器。适用于）：是一种通用型检测器。适用于挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类、高级脂肪酸、挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类、高级脂肪酸、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等。维生

13、素、氨基酸、甘油三酯及甾体等。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 二、色谱流出曲线二、色谱流出曲线试样中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱，经试样中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱，经检测器转换为电讯号，然后用记录仪将各组分的浓度变化记录下来，检测器转换为电讯号，然后用记录仪将各组分的浓度变化记录下来，即得色谱图。色谱图是以组分的浓度变化作为纵坐标，流出时间作即得色谱图。色谱图是以组分的浓度变化作为纵坐标，流出时间作横坐标的，这种曲线称为色谱流出曲线。横坐标的，这种曲线称为色谱流出曲线。三、色谱中有关术语三、色谱中有关术语 高效液相色谱法的基本概念及理论基础，如保留值、分配

14、系数、高效液相色谱法的基本概念及理论基础，如保留值、分配系数、分配比、分离度、塔板理论、速率理论等与气相色谱法是一致的，分配比、分离度、塔板理论、速率理论等与气相色谱法是一致的，但有其不同之处。液相色谱法的流动相为液体，气相色谱法的流动但有其不同之处。液相色谱法的流动相为液体，气相色谱法的流动相为气体。相为气体。液体的扩散系数只有气体的万分之一至十万分之一、液液体的扩散系数只有气体的万分之一至十万分之一、液体的粘度比气体大一百倍，而密度为气体的一千倍左右体的粘度比气体大一百倍，而密度为气体的一千倍左右（见表（见表8-2）。）。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 参数参数气体气体液体液体扩散系数扩

15、散系数 D Dm m/cm/cm2 2ss-1-11010-1-11010-5-5密度密度 /gcm/gcm-1-11010-3-31 1粘度粘度 /g/g（cmscms）-1-11010-4-41010-2-2表表 8-2影响峰扩散的主要物理性质影响峰扩散的主要物理性质 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 第三节液相色谱操作第三节液相色谱操作1 1、 操作条件的选择操作条件的选择 在高效液相色谱中，液体流在高效液相色谱中，液体流动相的分子量要比气相色谱中的动相的分子量要比气相色谱中的气体流动相的分子量大得多，由气体流动相的分子量大得多，由于被测组分在流动相中的扩散系于被测组分在流动相中的扩散系

16、数数D Dm m与流动相的分子量成反比，与流动相的分子量成反比，因此速率方程中的分子扩散项因此速率方程中的分子扩散项 B/uB/u较小，可以忽略不计，故只较小，可以忽略不计，故只有两项，即有两项，即 HACu液相色谱与气相色谱两者的液相色谱与气相色谱两者的H-u曲线的形状不同，如图曲线的形状不同，如图8-2所示。所示。8-2高效液相色谱分析高效液相色谱分析 1.1 流速流速：在液相色谱中，被测组分分子在流动相中的：在液相色谱中，被测组分分子在流动相中的扩散系数比气相中小扩散系数比气相中小45个数量级，当流速大于个数量级，当流速大于0.5cms-l时，时， H-u曲线是一段斜率不大的直线。曲线是

17、一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流速仍是一个调整分离度高不是很大。但在实际操作中，流速仍是一个调整分离度和出峰时间的重要的可选择参数。和出峰时间的重要的可选择参数。 1.2 固定相固定相液液-液分配色谱法固定相液分配色谱法固定相 全多孔型担体：可由氧化铝、氧化硅、硅藻土制成全多孔型担体：可由氧化铝、氧化硅、硅藻土制成 表面多孔型担体：试样容量低，需配较高灵敏度检测器表面多孔型担体：试样容量低，需配较高灵敏度检测器 化学键合固定相：目前应用最广泛的固定相。化学键合固定相：目前应用最广泛的固定相。液液-固吸附色谱法固吸附色谱法 吸附剂有硅胶、氧化铝、

18、分子筛、聚酰胺等。仍可分为吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。仍可分为全多孔型和薄壳型。全多孔型和薄壳型。 1.3 流动相流动相 选择流动相时选择流动相时应注意下列几个问题应注意下列几个问题： （1）流动相纯度流动相纯度 一般采用色谱纯试剂，防止微量杂质长一般采用色谱纯试剂，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免使用会引起柱效降低或保留特性变化的溶剂避免使用会引起柱效降低或保留特性变化的溶剂。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝吸附剂固定相等如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝吸附剂固定相等 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解

19、度，试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀防止产生沉淀并在柱中沉积并在柱中沉积 （4）溶剂粘度要小）溶剂粘度要小 （5）应与检测器相匹配应与检测器相匹配 当使用紫外检测器时，流动相不当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。应有紫外吸收。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 流动相的极性流动相的极性：在液液色谱中，为了避免固定液的流失，一般来说，在液液色谱中，为了避免固定液的流失，一般来说，对于亲水性固定液常对于亲水性固定液常采用疏水性流动相采用疏水性流动相，即流动相的极性，即流动相的极性固定相的极性，这种情况称为正相固定相的极性，这种情况称为正相液液色谱法，极性柱也称为正相柱。反之，为反相

20、液液色谱，非极性柱也液液色谱法，极性柱也称为正相柱。反之，为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。对于目前常用的化学键合固定相来说，固定液的流失大大减称为反相柱。对于目前常用的化学键合固定相来说，固定液的流失大大减小，流动相的选择范围则要大得多。小，流动相的选择范围则要大得多。常用溶剂的极性（由小到大）顺序如常用溶剂的极性（由小到大）顺序如下下： 庚烷、己烷、环己烷、四氯化碳、甲苯、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、庚烷、己烷、环己烷、四氯化碳、甲苯、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、丁酮、四氢呋喃、丙酮、丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、甲酰胺、水。正丁醇、丁酮、四氢呋喃、丙酮、丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、甲酰胺、水。 为获得合适的溶剂强度（极性），为获得合适的溶剂强度（极性），常采用二元或