壳聚糖对白血病细胞糖基转移酶表达的影响及对细胞的抑制作用

1、壳聚糖对白血病细胞糖基转移酶表达的影响及对细胞的抑制作用【摘要】 目的： 观察壳聚糖对白血病细胞（K562,SHI1）的作用。方法： 以不同浓度的壳聚糖处理白血病细胞K562后，运用RTPCR方法检测实验组K562细胞中多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAcT2）mRNA表达差异。另用不同浓度的壳聚糖分别作用于白血病K562细胞和SHI1细胞，MTT法检测壳聚糖对两种细胞的相对抑制率。结果： 与阴性对照组比较，实验组K562细胞的ppGalNAcT2表达降低，且随壳聚糖浓度升高，表达量进一步减少；MTT实验显示不同浓度的壳聚糖对K562细胞和SHI1细胞均有抑制作用，并呈浓度依赖性。

2、结论： 壳聚糖对肿瘤细胞有一定的抑制作用，同时还可以减少ppGalNAcT2在mRNA水平的表达。 【关键词】 多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2； 壳聚糖； RTPCR； 白血病细胞Abstract Objective: To observe the effect of chitosan on leukemia cells(K562,SHI1).Methods： The leukemia cells were treated by different concentration of chitosan. The expression of ppGalNAcT2 on K562 cells wer

3、e determined by RTPCR method. The leukemia cells were treated by different concentration of chitosan， and the relative inhibition rate was determined by MTT assay. Results： With adding the chitosan to compare with the negative group, the expression of ppGalNAcT2 in the experimental group K562 cells

4、reduced, and had the inverse ratio with the chitosans concentration. In the MTT assay, the chitosan with various concentrations had the inhibitory action on the K562 cells and the SHI1 cells. Conclusion： The chitosan suppressed the K562 cells and the SHI1 cells multiplication, and its action advance

5、d along with the concentration. Chitosan influenced the expression of ppGalNAcT2 in leukemia cell K562 reduced its expression quantity.Key words ppGalNAcT2; chitosan; RTPCR; leukaemia cell壳聚糖化学名：（1，4）N乙酰D葡萄糖胺是甲壳素（chitin）经脱乙酰化得到的产物，又名甲壳胺、脱乙酰壳多糖等，是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在体内能被溶菌酶等降解，降解产物能完全被人体吸

6、收，无毒副作用1。近年研究表明壳聚糖及其衍生物有抗肿瘤和增强机体免疫功能作用。杜昱光等2发现壳寡糖在体外可抑制肝癌、宫颈癌、白血病和S180腹水癌等多种癌细胞的生长，并抑制肿瘤细胞的DNA合成，在体内壳寡糖可抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并延长其生存期。本实验以慢性髓源性白血病细胞K562的多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2（ploypeptide：Nacetylgalactosaminyltransferase2，ppGalNAcT2）作为研究对象，对不同浓度壳聚糖作用48 h后的白血病细胞ppGalNAcT2的mRNA表达变化进行探索，同时利用MTT法检测壳聚糖对K562和急性单核细胞白血病细胞SH

7、I1的相对抑制率，为壳聚糖作为抗肿瘤辅助药物提供依据。1 材料与方法1.1 材 料 壳聚糖胶囊由中科院大连化学物理研究所馈赠，RPMI1640培养基为美国Gibco产品，Taq DNA聚合酶,dNTP MIX为MBI公司产品，MTT购自Sigma公司，PCR仪为美国MJ产品，酶联免疫检测仪为BioTek产品。1.2 壳聚糖的配制 从壳聚糖胶囊中获得壳聚糖，用无血清培养基配成相应浓度。1.3 细胞的培养与处理 白血病细胞SHI1由苏州大学附属第一人民医院血液研究所提供，K562细胞由本教研室复苏后常规培养（37,5% CO2)。细胞生长至对数生长期，分为4组，使壳聚糖浓度分别为0，50，100，

8、200 g/ml。常规培养48 h后收集细胞。 1.4 总RNA的制备与鉴定 细胞总RNA的提取采用 Trizol一步法3。用752紫外分光光度计分别于260 nm和280 nm处测量D值。以D（260 nm)与D(280 nm)的比值确定RNA的纯度，以D(260 nm)值确定RNA的量并稀释到终浓度为1 g/ml。 1 l样品RNA含量=D(260 nm)×40 g/ml×稀释倍数1.5 RTPCR反应（两步法）检测ppGalNAcT2表达1.5.1 反转录cDNA反应体系 六碱基随机引物 1 l；ddH2O（DEPC处理）12 l；25×10 min预热；细

9、胞株RNA（1 g/ml） 5 l；dNTP MIX 1 l；上下颠倒混匀并离心，65×5 min；迅速置于冰上至少1 min，再加入5×firstband 缓冲液 5 l；反转录酶（200 U/l）1 l；上下颠倒混匀并离心，42×50 min，70×20 min，37×20 min后进行PCR反应。1.5.2 扩增PCR反应体系 10×PCR 缓冲液5 l；MgCl2(25 mmol/L) 3 l；dNTPs(10 mmol/L)1 l；Taq E(5 U/l) 0.3 l；引物（各10 pmol/l）1+1 l；上述反转录生成的

10、cDNA 2 l；无RNase ddH2O 36.7 l；反应条件： 94预变性 5 min，94 变性 45 s，55 退火 50 s，72 延伸1 min。35个循环,72 再延伸 7 min。1.6 1.5%琼脂糖凝胶电泳 RTPCR扩增产物20 l与上样缓冲液4 l混合上样，与pUC MIX DNA 标准参照物一起在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离。在1×TAE电泳缓冲液中100 V恒电压电泳45 min，溴化乙啶（EB）染色，UVP图像分析仪摄像并分析结果。1.7 MTT比色法 实验在96孔塑料培养板中进行，K562细胞和SHI1细胞以浓度为1×105/ml铺板。阴性

11、对照组以培养基代替药物；实验组药物终浓度为50，100，200，400，800 g/ml。每组设3个复孔，设3个空白调零孔。常规培养，于44 h加入MTT，继续培养4 h，加入SDS/HCl终止反应，并于37放置约4 h，使结晶溶解，用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测光密度，计算3个孔D的平均值，按下式计算不同浓度壳聚糖对细胞的抑制率。相对抑制率=阴性对照组D值-实验组D值阴性对照组D值×100%2 结果2.1 壳聚糖对K562细胞中ppGalNAcT2表达的影响 从条带的亮度可以看出，阴性对照组的ppGalNAcT2表达量最高，加入壳聚糖后表达降低，且随药物浓度增加，表达逐步减

12、弱（图1）。软件计算ppGalNAcT2与内参actin条带亮度的相对值，得到ppGalNAcT2的相对表达柱形图，随着壳聚糖浓度的升高，ppGalNAcT2的表达量明显下降（图2）。 14：壳聚糖浓度依次为0，50，100和200 g/ml；M：标准参照物图1 K562细胞ppGalNAcT2的表达（略）Fig 1 Expression of ppGalNAcT2 on K5622.2 壳聚糖对K562细胞增殖的相对抑制率 壳聚糖在体外能抑制K562细胞的生长。低浓度壳聚糖对细胞的抑制作用不明显，低于200 g/ml浓度时其对细胞的抑制率小于10%，但随着壳聚糖浓度的升高，细胞的生长抑制率迅

13、速升高，当壳聚糖浓度为800 g/ml时有多数细胞生长明显受到抑制，抑制率达60.57%（图3）。 14：壳聚糖浓度依次为0,50,100和200 g/ml图2 K562细胞T2的相对表达（略）Fig 2 Relative expression of ppGalNAcT2 on K562图3 壳聚糖对K562细胞的抑制作用（略）Fig 3 Inhibition effect of chitosan on K5622.3 壳聚糖对SHI1细胞增殖的相对抑制率 壳聚糖在体外同样能抑制SHI1细胞的生长。低浓度壳聚糖对细胞生长抑制作用不明显，但随浓度升高抑制率迅速升高。浓度在200 g/ml时，抑制

14、率为10.75%，而当浓度达800 g/ml时抑制率为41.81%（图4）。相对于K562细胞，壳聚糖对SHI1细胞的抑制作用较弱。 图4 壳聚糖对SHI1细胞的抑制作用（略）Fig 4 Inhibition effect of chitosan on SHI13 讨论 肿瘤细胞中的糖蛋白糖链结构异常与肿瘤的生物学行为，如恶性转化、转移和浸润等密切相关，而糖链结构异常的基础是糖基转移酶的变化4。因此，研究肿瘤细胞的糖基转移酶表达差异，有助于了解肿瘤的生物学行为机制。通过研究浸润性不同的白血病细胞株的糖基转移酶表达差异，有助于揭示糖基转移酶与白血病细胞株浸润能力的关系，从而为从糖生物学角度治疗白

15、血病提供思路。 白血病是一种造血组织的恶性疾病，俗称“血癌”，是某一类型的白血病细胞在骨髓或其他造血组织中的肿瘤性增生，可浸润体内各器官、组织，使各个脏器的功能受损，产生相应的症状和体征。糖基化是真核细胞蛋白质转录后修饰方式中的一种。这些糖蛋白与一系列的生物学功能有着广泛的联系，如细胞间的黏附，自我与非自我的识别，分子运输与清除，受体激活，细胞的内吞作用等。某些糖基转移酶活性升高或降低,就会产生癌变，故一些糖基转移酶活性被视为癌变的重要标志。本实验用RTPCR方法检测壳聚糖作用于K562细胞后ppGalNAcT2的mRNA表达变化，ppGalNAcT2在未处理组K562细胞中表达较高，随着加入

16、壳聚糖浓度的提高，表达量逐渐降低。结果表明壳聚糖可抑制白血病细胞K562的ppGalNAcT2表达。 甲壳素作为一种天然的碱性多糖，具有抗癌作用。实验证明，特别是甲壳素六聚糖具有很强的抑制肿瘤作用，它通过增强机体非特异性免疫对肿瘤有抑制作用，其机制是促进巨噬细胞活性，作用途径是影响非杀伤性细胞（NK）活性IL2的分泌6。本实验采用MTT法，用不同浓度壳聚糖作用于白血病细胞K562，SHI1，于48 h后检测D值，发现随壳聚糖浓度升高，其对细胞的抑制率逐渐增加。但在低浓度时有波动，可能由于实验是微量操作，细胞浓度和加样量的极微差异都会导致实验结果的波动。实验结果显示壳聚糖对细胞有抑制作用，但对低

17、浓度壳聚糖的抑制作用，还需调整实验中多糖浓度进一步研究。 通过本次实验发现壳聚糖对白血病细胞K562和SHI1都有抑制作用，其机制可能是带阳离子的壳聚糖，直接作用于带负电荷比正常细胞多的肿瘤细胞，从而抑制了实验中两种细胞的生长。但也不排除其他的可能。近年来,研究发现细胞凋亡的异常在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用,许多抗肿瘤药物都是通过诱导细胞凋亡而发挥其作用。新近研究表明壳聚糖也具有诱导细胞凋亡的作用，Hasegawa等7研究发现壳聚糖可诱导膀胱癌细胞凋亡,从而抑制其增殖。肿瘤细胞的凋亡受许多因素的影响,其中癌基因、抑癌基因、细胞因子在其中起着重要作用。因此,诱导肿瘤细胞凋亡也可能是壳聚糖抑制

18、肿瘤细胞生长的重要机制。 多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)催化O聚糖合成的第一步反应，将UDPGalNAc上的GalNAc基团转移至蛋白多肽链上特定序列中的Thr或Ser从而合成GalNAcOSer/Thr。ppGalNAcT及其家族作为黏蛋白O糖基化的起始酶，在一些蛋白质上，OGlcNAc和O磷酸化相互竞争同一或邻近的位点8，可能与肿瘤的生长和转移，细胞的信号传导等密切相关。肿瘤细胞表面可有类似黏蛋白的糖蛋白，含有丰富的O糖基化结构域，在肿瘤的转移和浸润生长过程中黏蛋白起着重要的作用，ppGalNAcT可能通过各种途径调节细胞的生长及浸润转移，在肿瘤的发生发展中起着重要的作

19、用。通过本次实验结果，初步推测壳聚糖降低白血病细胞K562的糖基转移酶ppGalNAcT2的表达，同时ppGalNAcT2的表达降低可能影响K562细胞的生长与转移浸润，使细胞的生长受到抑制，正如MTT试验结果显示，加入壳聚糖后细胞生长受到不同程度的抑制。但白血病细胞K562的糖基转移酶ppGalNAcT2表达的降低与细胞增殖受到抑制，这两者之间是否存在某种联系，还需进一步实验研究探讨。【参考文献】 1 Angnihotri SA,Mallikarjuna NN,Aminabhavi TM. Recent advances on chitosanbased micro and nanoparticles in drug delivery J. J Control Re1ease,2004, 100(1) : 5-28.2 杜昱光, 白雪芳, 金宗濂, 等. 壳寡糖抑制肿瘤作用的研究J. 中国海洋药物, 2002, 21(2) : 18-21.3 仇 灏