CCK-8法（课堂PPT）

1、1细胞毒性及细胞毒性及CCK-8法法2细胞毒性 细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。 细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测。 常用的几种方法检测细胞毒性的方法：MTT法、XTT法，CCK-8法，LDH的方法以及其它酶的方法。3 MTT、XTT，CCK-8：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测。 LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性。 其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞毒性4原理 细胞增殖能力分析试剂盒 正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的

2、琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如 MTT、XTT、WST-1等 ）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态 荧光素发光法细胞生存能力检测 腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP生成ATP。当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。 5LDH法细胞毒性检测 LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色

3、的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度6CCK-8 Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。 WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活

4、细胞数量。7CCK方法的优势 8实验方法实验方法比色用含10胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液以每孔40005000个细胞接种到96孔板每孔100ul.培养 每孔加CCK8溶液 20ul，孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150ul DMSO振荡10分钟 选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 接种培养细胞呈色9CCK-8优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。缺点：1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生