风疹病毒感染与先天性心脏病关系的研究

1、    风疹病毒感染与先天性心脏病关系的研究*        摘要目的：为寻求诊断风疹病毒(RV)感染敏感、特异的方法，进一步确定RV与先天性心脏病(CHD)的关系。方法：以RV特异的糖蛋白E1编码的基因保守序列设计引物，采用RT-PCR技术，对30例CHD及20例非先天畸形(对照组)尸体的心肌组织标本进行RV基因的检测。结果：成功地提取了RV的RNA，反转录合成cDNA经扩增得到423 bp cDNA区带。30例CHD阳性7例(23.3%)，与对照组相比有显著性差异(P=0

2、.032 8)。结论：建立的RV RT-PCR方法具有良好的敏感性和特异性，从分子水平进一步证实RV感染为CHD发病的重要因子。关键词风疹病毒感染先天性心脏病聚合酶链反应 Study on relationship between rubella virus infection andcongenital heart diseaseWang XiaomingZhang GuochengHan Meiyu(Department of pediatrics,Xijing Hospital,the Fourth Military MedicalUniversity,Xian 710032)Abstr

3、actObjective:To find a sensitive and specific method for diagnosis of rubella virus (RV) infection and explore the relationship of RV infection with congenital heart disease (CHD).Method:The cardiac tissue was taken from 30 cadavers of CHD and 20 cadavers of non-CHD.Primers were derived from RV gene

4、 encoding sequence of the enveloped protein E1 which was highly conserved in rubella virus by reverse transcription-PCR in cardiac tissue.Result:RV-RNA was extracted and cDNA was compounded by reverse transcription. The cDNA bands around 423 bp was obtained by amplification.7 of 30 cases were positi

5、ve in cardiac tissue of CHD,compared with control group,it was significantly higher (P=0.032 8). Conclusion:The method of RV RT-PCR was successfully set up and its sensitivity and specificity were satisfactory. RV was proved as an important factor which led to CHD in molecular level.Key wordsRubella

6、 virus infectionsCongenital heart diseasePolymerase chain reaction风疹病毒(RV)是引起先天异常的主要病原体之一，其宫内感染致先天性心脏病(CHD)的关系已通过风疹流行病学调查及大批风疹疫苗的干预所证实1，2。为进一步从分子水平证实其因果关系，我们首次采用RT-PCR对30例CHD及20例非先天畸形(对照)尸体的心脏组织标本进行RV基因检测。1对象与方法1.1对象CHD组30例心脏组织取材于19771997年第四军医大学病理解剖教研室尸体解剖标本，男17例，女13例，死龄1 d18(平均3.8)岁；其中新生儿11例。对照组20例

7、为同期尸体解剖的非先天畸形心脏组织标本，病种有：新生儿窒息10例，新生儿硬肿症5例，呼吸窘迫综合征2例，肺炎合并心力衰竭3例；死龄1 d5岁(平均8个月) 。1.2材料RV及引物：RV来源于本校分子病毒室，引物按文献3由美国GIBCO BRL公司合成。靶片段源于RV特异的糖蛋白E1编码的基因保守序列。引物R1对应于RV-RNA碱基位置为：1054-1073。R2对应于651-670，循环产物为423 bp，引物碱基序列为R1：5-AACTTCAGCCCCAAGGGGCC-3，R24为标本进行切片，经脱蜡、脱脂后，加入异硫氰酸胍裂解液53：逆转录合成cDNA：总反应体积20 l，5×R

8、T-PCR缓冲液5 l，4×dNTPs 2 l，AMV 25 u，RNasin 20 u，R1、R2500 ng，RNA模板8 l(同时作RV阳性、阴性对照)。混合42 30 min，95灭活逆转录酶100 min，冰浴5 min。cDNA-PCR：总反应体积100 l，上述逆转录产物20 l，加入10×PCR缓冲液10 l，Taq DNA酶2.5 u,无RNase水68 l，覆盖石蜡油，PCR条件：95 60 s，60 60 s，72 60 s，共45个循环，72 5 min。每次均设RV阳性及双蒸水阴性对照，产物于电泳带423出现荧光为阳性。同批用该引物作巨细胞病毒(C

9、MV)、单纯疱疹病毒(HSV)、弓形体(TOX)、人微小病毒B19 PCR检测，均为阴性(特异性试验)。2结果RV的RT-PCR的特异性：取RV的RT-PCR扩增产物10 l于2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫光灯下观察到423 bp处一荧光亮带为阳性，而用该法作CMV、HSV、TOX、人微小病毒B19均阴性(见1)，证明该引物检测RV特异性良好。1RT-PCR检测CHD心肌组织中RV电泳结果1.阴性对照；2.PGEM；3.RV-cDNA阳性对照；4.CMV阳性对照；5、6.RV-cDNA阳性标本；7.HSV阳性对照;8.TOX阳性对照；9.B19阳性对照CHD心脏组织中RV的检测：30例CHD石蜡心

10、脏组织中RV-RNA阳性7例(23.3%)，而对照组20例均阴性，两组比较有显著性差异(2=5.32，P=0.032 8)。3讨论先天性RV感染可引起胎儿严重的后果如流产、早产、死胎及胎儿异常1，2，6，因而对RV感染诊断技术的改进十分重要，目前常用的病毒分离和抗体检测两种方法在临床应用存在着局限性，特别是进行缺乏血清标本的微量病毒基因分析，显得更是无能为力，而分子生物学技术的应用使其变成可能。由于RV核酸为RNA极易降解，故进行RT-PCR的关键是RNA的提取及逆转录cDNA合成的过程，我们采用改良的异硫氰酸呱、酚、氯仿一步法提取石蜡包埋心脏组织的RNA，实验证明该法不但快速、简便，而且所提

11、取的RNA较完整，保证了PCR检测微量基因的敏感性。采用相同的PCR体系、条件，更换不同的病毒阳性模板，结果CMV、HSV、TOX、人微小病毒B19均阴性，进一步支持了该法检测RV具有良好的特异性。RV感染与先天异常的证实得力于临床流行病学(临床症状及抗体检测)及大批风疹疫苗的干预，特别是RV与CHD的因果关系因此而被确认，但目前尚无分子水平的证据，Givens等6对近32年来125例先天风疹综合征患者的分析发现，眼科疾病占78%，感染性耳聋占66%，精神运动性障碍占62%，精神发育迟缓占42%，先天性心脏缺损占58%。国内仅有刘正乐等7采用病例对照研究对140例CHD组及对照组经RV抗体检测，提示RV感染与CHD发病有关。本研究采用RT-PCR技术从CHD的心肌组织标本中直接检测到了RV的基因，其阳性率为