western blot详细步骤

1、实验室308蛋白质电泳1粗酶液提取取1g鲜样,加2mL提取缓冲液含Hepes100mmol/L(pH7.4,EDTA2mmol/L,甘油12.5% (V/V,MgCl28mmol/L,巯基乙醇50mmol/L,放置冰上研钵,研磨至匀浆,4下20000 r/min离心10min,取上清;用2mL提取缓冲液重悬沉淀,12000r/min离心5min,将上清合并,作为备用粗酶液。2总蛋白含量的测定(Bradford法1标准曲线的制作取6支试管,按下表加入试剂,摇匀,并放置5min左右,以0号管为空白对照,在595nm下比色测定吸光度绘制标准曲线。表2-1各试管中试剂加入量Table2-1The co

2、ntent added into each test tube试剂试管012345考马斯亮蓝试剂(ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0蛋白质含量(g020*2吸取1.0ml蛋白质样品加入5mL考马斯亮蓝试剂,混合摇匀,2min后用分光光度计测量595nm下蛋白质吸收值。根据标准曲线计算待测样品的浓度:蛋白质含量(mg/g=CV TN/(WV S1000C:从标准曲线上查得蛋白质的质量,gV T:样品提取液总体积,mlV:显色时取样品液量,mlW:样品重,g N:稀释倍数标准(100g/ml牛血清蛋白溶液:称取牛血清蛋白25mg,加水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml用

3、蒸馏水稀释至100ml。考马斯亮蓝G-250溶液:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml95%的乙醇中,加入100ml85%(w/v的磷酸,再用蒸馏水定容到1L,过滤置于棕色瓶中保存。3.配胶(1洗净电泳用的玻璃板,晾干,按仪器使用说明装好。(2配12%分离胶15mL(3块胶的量,分别取:1.5M pH8.8Tris-HCl 3.75mL(分离胶缓冲液40%Acryl/Bis 4.5mL,dd H2O 6.5mL10%SDS150LTEMED15L(夏季室温高可少加10%APS75L(夏季室温高可少加现用现配,最后加混匀,灌胶。(3灌好分离胶,上面用200L异丙醇封好。(4待分离胶凝

4、固后(凝胶时间半小时左右,配4%浓缩胶(2.3ml:0.5M pH6.8Tris-HCl 1.5mL,(浓缩胶缓冲液40%丙烯酰胺2mL,dd H2O3mL10%SDS60L,TEMED15L(夏季室温高可少加10%APS30L(夏季室温高可少加现用现配,最后加混匀。(5用双蒸水洗净胶上的异丙醇,灌入浓缩胶,插入梳子,凝固半小时以上。(6待胶凝固后,拔出梳子,加入电泳缓冲Buffer。(7蛋白上清液用15L2SDS上样缓冲液悬浮,煮5分钟,12000rpm离心10min,取上清。(8按顺序上样,同时上标准相对分子质量的蛋白质样品。上样量为:Marker(5L,样品(10L(9开始电泳时用80V

5、,待样品全部进入胶后增大到120V。(10溴酚蓝指示剂电泳到分离胶底部时(距底部1cm左右,停止电泳。4.电泳转移(1切掉无效的浓缩胶。(2量好尺寸,按尺寸大小切割硝酸纤维素膜(3在转移板上按顺序操作,每一步不能有气泡:用转移Buffer浸湿后的海绵片一张(接触转移板黑色部分用转移Buffer浸湿后的滤纸两张放上切割好的胶胶上放硝酸纤维素膜,正面贴胶湿滤纸两张湿海绵片一张(接触转移板白色部分(4合上转移板,放入电泳槽,注意电极胶靠负极。倒入转移缓冲液。以没过三明治夹为准。(5插入电极,100mA恒流电泳90min。(6转移结束后,取出硝酸纤维素膜。5.免疫印迹(1用TBS缓冲液洗膜10min,

6、在摇床上轻轻摇动。(2将膜用封闭溶液封闭,用37摇床轻轻摇动2h。(3轻轻地转移掉封闭溶液,并用TBS溶液洗膜两次。悬浮洗膜一次,第二次10min。(4用锡箔纸叠一个稍大于硝酸纤维素膜的盒子,将硝酸纤维素膜正面朝上贴入锡纸盒。(5将10ml一抗溶液(一抗原液:封闭液=1:500倒入锡纸盒。(64过夜。(7去掉第一抗体溶液,用TTBS洗膜3次,每次10min,置于摇床上轻轻摇动。(8按照和一抗同样的操作用二抗溶液孵育硝酸纤维素膜。二抗:抗体稀释液按1:1000稀释(二抗偶联碱性磷酸酶。(9室温结合2h。(10用TBST洗3次,每次10min。(11用TBS溶液洗膜一次。(12显色,NBT/BCI

7、P显色法。 按照上述方法准备两个锡纸盒子,将硝酸纤维素膜正面朝上铺入盒子 取10ml检测液,分别加入66L NBT、33L BCIP,迅速混合。倒入锡纸盒中,晃动3min,等条带显出来以后,加去离子水终止反应。(13观察条带,然后照相。6.试剂配方附录1.10%SDS:称10g SDS用双蒸水溶解,定容到100ml,室温放置。2.10%过硫酸铵(1ml:称0.1g过硫酸铵溶于1ml双蒸水中,在4冰箱中可保存3-4个星期。注:过硫酸铵最好现配现用,否则必须加大用量。配两管。25mmol/L Tris 3.03g250mmol/L甘氨酸18.77g0.1%SDS,1g定容至1L25mmol/L Tris 3.03g192mmol/L甘氨酸14.41g0.1%SDS1g10%甲醇100mL定容至1L7.TBS(用ddH2O配i.配TBS2L pH7.520mmol/L TrisHCl5g500mmol/L NaCl58.5g调pH至7.5定容至1Lii.配TTBS1L(0.05%TBS1LTTBS200mLBSA0.6g8.NBT/BCIP检测液2