张忠亮鱼腥草茎在不同时期多糖含量比较

1、 本科毕业论文 （设计）( 2013届 ) 题 目： 鱼腥草茎在不同时期多糖含量比较 学 院： 生命与环境科学学院 专 业： 生物科学 学生姓名： 张忠亮 学号： 20909041084 指导教师： 余利华 职称（学位）： 工程师（硕士） 合作导师： 陈向阳 职称（学位）： 讲 师（硕士） 完成时间： 2013 年 5 月 25 日 成 绩： 综合成绩： 等级： 黄山学院教务处制学位论文原创性声明兹呈交的学位论文，是本人在指导老师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。声明人（签名）：201

2、3年 6 月 1 日目 录中文摘要英文摘要1引言51.1鱼腥草简介51.2鱼腥草的研究价值51.3超声波的作用原理52材料仪器和实验方法62.1材料仪器准备62.1.1材料的准备和处理62.1.2实验试剂62.1.3实验器材62.2试验方法62.2.1多糖含量测定原理6标准曲线的绘制6鱼腥草的脱脂脱色7单因子实验7正交试验9不同时期多糖的测量93实验结果与分析104.1标准的绘制104.2单因素实验114.3正交实验114.4不同时期多糖的测量124讨论13参考文献14致谢14鱼腥草茎在不同时期多糖含量比较张忠亮（20909041084）导师：余利华（工程师）合作导师：陈向阳（讲师）（黄山学院

3、生命与环境科学学院，黄山学院）摘要：先分别通过单因素实验和正交实验对鱼腥草茎中的多糖进行超声波提取，以鱼腥草提取率作为指标，分别对超声波浸提时间，水浴时间，水浴温度以及乙醇浓度这些因素进行考察，从而得出超声波提取鱼腥草茎中多糖的最好条件：超声波浸提时间30min，水浴时间90min，水浴温度80，乙醇浓度80%。然后在最佳条件下分别测四个不同时期下鱼腥草茎中多糖的提取率，从而得出鱼腥草茎中多糖在6月份含量比较丰富。关键词：鱼腥草；多糖；单因素；正交；超声波；不同时期Houttuynia cordata stems in the polysaccharide content in differe

4、nt periods Zhong-Liang ZHANG（20909041084）Supervisor: Li-Hua YU(Engineer)Co-supervisor:Xiang-Yang CHEN(Lecturer)(College of Life and Environment sciences, Huangshan University, Huangshan, 245041 China)Abstract:first by single factor experiment and orthogonal experiment for ultrasonic extraction of po

5、lysaccharide of Houttuynia cordata stems, rate as the index in Houttuynia cordata extraction, ultrasonic extraction time of time, water bath, water bath temperature and ethanol concentration on these factors, then the best extraction conditions of polysaccharide in Houttuynia cordata stems: ultrason

6、ic ultrasonic the extraction time, water bath time, water bath temperature, ethanol concentration. The extraction rate and then under the optimal conditions were measured at four different times of H. cordata stems polysaccharide, thus draws cordata stems polysaccharides rich in content.Key Words: H

7、outtuynia cordata; polysaccharide; single factor; orthogonal; ultrasonic; different periods 1 引言 1.1 鱼腥草特点 鱼腥草（Houttuynia cordata） 又名侧耳根，鱼鳞草等，是三白草科（Saururacere）蕺菜属(Houttuynia),是很常用中草药。为多年生草本植物，高3050厘米，常呈紫红色，下部伏地蔓生、生根，节上轮生小根。因其含有鱼腥气味，故而得名鱼腥草。鱼腥草生长于阴湿处或山涧边，常可在野地、路旁、庭园树下等较阴湿的地方发现，大片蔓生。该植物我国南方各地较常见。鱼腥草内

8、含有黄酮，蛋白质，多糖等等。由于多糖有多种生物活性，与生物机能的维持密切相关，各种植物多糖有很多的药理作用药理研究表明鱼腥草具有：抗菌作用，抗病毒作用，增强机体免疫功能，利尿作用抗炎抗过敏作用。还有学者发现，鱼腥草水溶性多糖多葡萄球菌，变形杆菌，大肠杆菌，沙门氏菌有不同的抑菌效果，七对双歧杆菌有促增效果2。其独特的功能和低毒性有很广的前景。 1.2 鱼腥草的研究价值 鱼腥草含有比较丰富的药用成分和营养成分，是一种药食兼用的野生植物，具有清热解毒，利尿消肿。治肺炎，肺脓疡，热痢，白带，痈肿，秃疮，疥癣等功效12。其富含人体所需的蛋白质，脂肪，钙，维生素C和维生素E等营养成分。其主要含有的是挥发油

9、和黄酮类。这些方面已有很多人做过相关的研究。而多糖是对人类很重要的化合物，人们从内到外都离不开它，而其多糖低毒性的性质也很值得去了解。本实验主要是借助超声波对不同鱼腥草茎内的多糖进行提取分析。进而分析出不同时期鱼腥草茎中多糖含量最为丰富的时期。为更高效的利用鱼腥草提供一定理论依据。1.3 超声波的作用原理超声波提取是很高效的一种强化提取效果的方法1,2,5,8。主要是利用超声波所产生的超声能，强烈的机械振动和空化效应。当超声波振动时，产生很大的能量，从而引起媒质以很大的速度进入加速的振动状态。使其结构发生变化，促使有效成分进入溶剂中。除此之外，超声波还在液体中国产生空化作用，而且伴随强大的冲击

10、波和微声波，以致细胞壁被破坏，植物内的物质成分会释放出来从而会提高相应物质的提取率。除此之外，超声波还有些像热效应，乳化等等，也会相应的提高物质的提取率5,15。2 材料仪器和实验方法 2.1. 1 材料的准备和处理鱼腥草是分不同时期（2012年4月20日,5月3日，5月28日，6月10日）在黄山学院南区内挖得，洗净后将根茎叶分开取茎，放入干燥相中恒温70干燥24小时，直至恒重，然后在粉碎机中粉碎放置在干燥的地方备用。2.1.2 实验试剂95%乙醇（上海振企化学试剂有限公司），浓硫酸（上海振企化学试剂有限公司），葡萄糖（天津博迪化工股份有限公司），石油醚（新陇化工股份有限公司），乙醚（扬州沪宝

11、化学试剂有限公司），蒸馏水，蒽酮（上海科丰化学试剂有限公司）。2.1.3 实验器材微型植物试样粉碎机 (金坛市杰瑞尔电器有限公司 ) ；电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（上海奥普勒仪器有限公司）；超声波清洗机（曙峰企业制造）；索氏提取器（上海新嘉电子有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣有限公司产品)；粉碎机；试管；量筒；烧杯；容量瓶等。2.2 实验方法2.2. 1 多糖含量测定原理利用苯酚-浓硫酸法测定多糖的含量3，因多糖在浓硫酸作用下，分子内脱水生成羟甲基糠醛或者

12、羟甲基糠醛，其与苯酚缩合生成一种橙红色化合物，在490nm波长下有最大的吸收峰，所以可以用比色法在此波长下测定吸光度2，进而算出多糖的含量。此法灵敏度高，基本不受蛋白质的存在干扰。而本次试验的基本流程是：材料的脱脂脱色，干燥，精确称量，加酒精，超声波浸提，水浴加热，静置，过滤取上清液，在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，静置，离心，取沉淀物加蒸馏溶解水并加热，过滤去除杂质，然后醇析离心，得到粗多糖，再定溶，最后按照苯酚-浓硫酸法测相应多糖的吸光度A值2,15，进而得出结论。2.2.2 标准曲线的绘制3,9利用电子天平精密称取干燥张致恒重的葡萄糖0.0966g加水溶解至100ml,然后再取1ml定容至10m

13、l容量瓶中，制的0.0966mg/ml的葡萄糖对照品储备液。取11支试管按0到11编号，0号作对照；1,2号加0.20ml葡萄糖储备液；3,4号加0.40ml葡萄糖储备液；5,6号加0.60ml葡萄糖储备液；7,8号加0.80ml葡萄糖储备液；9,10号加1.00ml葡萄糖储备液；然后将0到10号全部加蒸馏水定容至2.00ml；然后按照顺序向试管中加入1.00ml的9%的苯酚溶液和5.00ml的浓硫酸（浓硫酸加入一定要缓慢），摇匀，静置30分钟。最后以0号试管为参照，在490nm波长下测吸光度A值3,9。做好登记，以横坐标为糖含量，吸光度A值为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归的的求解见图3-

14、1。 2.2.3 鱼腥草粉末的脱脂脱色将不同时期的鱼腥草茎用电子天平精确称各取6包，每包1g，再称任一时期的材料9包，均用滤纸包好并做好标记。然后在索氏提取器中用石油醚脱脂脱色4小时，提取温度恒定在70。然后取出放入电热恒温鼓风干燥箱中在70下干燥12个小时以上，使之达到恒重。之后放入干燥箱中作为实验材料。脱脂脱色对其多糖的提取是很重要的步骤，脂类和色素的存在是很影响多糖的测定的，所以脱脂脱色要充分。2.2.4 单因子实验每次实验均取同一时期的“”中的材料四包，即每次取同一时期的4克，分别放入4个试管中，按下图表2-1，表2-2，表2-3和表2-4中依次编号，每支试管中均加20ml的乙醇，并且

15、按下面表格添加试剂和进行实验13,15。表2-1 乙醇浓度的选择实验table 2-1 Choice experiment ethanol concentration实验条件试管编号1.11.21.31.4乙醇浓度60%70%80%90%水浴温度70707070水浴时间30min30min30min30min超声波浸提时间30min30min30min30min表2-2 水浴温度选择的实验Table 2-2 bath temperature selection experiment实验条件试管编号2.12.22.32.4乙醇浓度70%70%70%70%水浴温度60708090水浴时间30min

16、30min30min30min超声波浸提时间30min30min30min30min表2-3 水浴时间选择的实验Table 2-3 bath time selection experiment实验条件试管编号3.13.23.33.4乙醇浓度70%70%70%70%水浴温度60708090水浴时间30min60min90min120min超声波浸提时间30min30min30min30min表2-4 超声波浸提时间的选择实验table 2-4 Choice experiment ultrasonic extraction time实验条件试管编号4.14.24.34.4乙醇浓度70%70%70%

17、70%水浴温度60708090水浴时间30min30min30min30min超声波浸提时间30min45min60min75min 然后静置过滤取上清液，滤液在RE-52AA旋转蒸发仪中浓缩，在静置12小时，在离心机中以3000r/min离心30min,然后沉淀物溶于蒸馏水中，加热去除不溶物，醇析离心，得到鱼腥草粗多糖，最后按照“”中的苯酚-浓硫酸法2在紫外可见分光光度计（490nm）中分别测其吸光度A值，作好记录。根据实验数据制作表格见图3-2。2.2.5 正交实验1,3,7,12在单因素的基础之上选择不同的乙醇浓度，水浴时间，水浴温度和超声波浸提时间为条件进行正交实验，取“”中单独处理的

18、16包材料为实验材料，分别放入16支试管中依次编号1到9号，加入的各梯度的酒精均为20ml。以确定鱼腥草的最佳提取工艺其各条件的试验情况见表2-5。表2-5 正交实验各因素的条件Table 2-5 factors orthogonal experiment conditions 条件 编号 超声波浸提时间（min）水浴时间（min）水浴温度（）乙醇浓度（%）5.1306070705.2309080805.33012090905.4456080905.5459090705.64512070805.7606090805.8609070905.9601208070然后静置过滤取上清液，滤液在RE-5

19、2AA旋转蒸发仪中浓缩，在静止12小时，在离心机中以3000r/min离心30min,然后沉淀物溶于蒸馏水中，加热去除不溶物，醇析离心，得到鱼腥草粗多糖，最后按照“”中的苯酚-浓硫酸法2在紫外可见分光光度计中分别测其吸光度A值，作好记录。制作表格见图3-3。2.2.6 不同时期多糖含量的测定 在单因素实验和正交实验的基础上选择最佳的实验条件，即乙醇浓度80%，水浴温度80%，水浴时间90min和超声波浸提时间30min。分别取各个时期的“”中的材料各一包，分别放入4支试管中，依次编号6.1，6.2，6.3，6.4对应的鱼腥草茎的日期为4月20日，5月3日，5月28日，6月10日。和上面一样加入

20、酒精的体积也为20ml然后按照表2-6进行操作。表2-6 不同时期多糖含量测定的实验Table 2-6 determination of polysaccharide content in different periods of experimenttable 条件 编号 乙醇浓度（%）水浴温度（）水浴时间（min）超声波浸提时间(min)6.1808090306.2808090306.3808090306.48080903然后静置过滤取上清液，滤液在RE-52AA旋转蒸发仪中浓缩，在静止12小时，在离心机中以3000r/min离心30min,然后沉淀物溶于蒸馏水中，加热去除不溶物，醇析离心

21、，得到鱼腥草粗多糖，最后按照“”中的苯酚-浓硫酸法2在紫外可见分光光度计中分别测其吸光度A值，作好记录，根据数据制作表格见图3-3。3 实验结果 3.1 标准曲线的绘制表3-1 葡萄的糖标准曲线 Grape 3-1 Glucose standard 图3-1所示标准曲线回归方程:Y=1.5312X+o.0006,R²=0.9906其吸光度与浓度呈现出良好的线性关系。 3.2 单因素实验 图3-2 鱼腥草茎部多糖提取单因子实验结果图 Grape 3-2 Extraction of single factor experiment results polysaccharidecordat

22、a stems. 由单因素的实验结果图可以看出在固定三个变量恒定的情况下，吸光度最大，即鱼腥草茎部多糖的提取率最大的条件为乙醇溶液的浓度为80%，水浴温度为80，水浴时间为120min，超声波浸提时间为45min。3.3 正交实验 表3-1 鱼腥草茎部多糖提取的正交实验结果3,16，7table 3-1 Results of orthogonal test Houttuynia cordata stems polysaccharide extraction 条件 编号 超声波浸提时间（min）水浴时间（min）水浴温度（）乙醇浓度（%）提取率mg/g5.1306070703.8615.2309

23、080806.0235.33012090904.7265.4456080903.7545.5459090705.4565.64512070804.3785.7606090802.7655.8609070905.3975.96012080704.345K14.7803.4604.5454.554K24.5315.6274.7074.389K34.1694.4834.3164.631R0.6112.1670.3910.242由表3-1 鱼腥草茎部多糖提取的正交实验结果可知对鱼腥草茎部多糖提取率影响的主要因素依次为：水浴时间>超声波浸提时间>水浴温度>乙醇浓度；而提取率最佳的组合为

24、:超声波浸提时间为30min，水浴时间为90min，水浴温度为80，乙醇浓度为80%；在这个组合的条件下其鱼腥草茎部的提取率为6.023mg/g。 3.4 不同时期多糖的测定 图3-3 不同时期鱼腥草茎部多糖提取测定图Grape 3-3 Determination of Fig.in different periods of Houttuynia cordata stems to extract polysaccharide 由图3-2可以看出6月10日的鱼腥草吸光度最大，所以相对其他时期而言其茎部多糖的含量比较丰富。4 讨论本次试验通过单因子实验，正交试验对鱼腥草茎部多糖的提取率的四个影响因

25、子进行比较分析，选择出组合搭配最佳的一组，即为乙醇浓度80%，水浴温度80，水浴时间80min和超声波浸提时间30min。在这个组合下经过对不同时期鱼腥草茎部的多糖含量进行比较可知，6月份的多糖含量比较高。这次的实验只考虑了四个刚面的单因子，其实影响多糖的提取率的因素还有许多，比如料液比，超声波的频率等等，要想更佳全面准确的分析鱼腥草多糖的提取率，这些因素都是不可以忽略的。就本实验而言是比较不同时期的含量的大小，所以不是那么重要。从整个实验过程核试验数据的结论来看，整个四个时期多糖含量并未表现出怎样的规律，而且多糖含量之间的差异也很小，这样的结果可能有多方面的原因。首先，从材料的获取上鱼腥草四

26、个时期间隔的太短，在时间上并不能体现出差距，材料采集的时期上也没有季度上的跨度，因而多糖含量的变化并不是表现得很明显。另一方面，在材料的获取上，是在黄山学院南区，但并不是同一个地方挖取得，各个地方的土地环境光等等照条件不一样，所以鱼腥草长势的条件差异很大，这也是对其含量影响比较大的因子。从图3-3来看，6月份以后鱼腥草茎部多糖的含量可能还会上升。所以要更明显有效测定鱼腥草茎部多糖含量的情况，应将时间跨度拉大，并且侧更多的时期而且鱼腥草的来源应相同。从单因子实验到正交实验中，我们可以明显的看到，在单因子试验中各个提取率最高的的影响因子的组合，并不是正交试验的最佳组合。各个影响因子对多糖提取率的影

27、响是有大小的从，本实验表3-1看出对鱼腥草茎部多糖的提取影响从大到小为水浴时间，超声波浸提时间，水浴温度和乙醇浓度。而只有在最佳的组合水浴时间90min，水浴温度80，超声波浸提时间30min，和乙醇浓度为80%条件下达到最大的提取率。而在多糖提取的过程中超声波的作用是关键的，它破坏细胞，改变植物组织，发挥它像空化作用等特殊的作用加速以及提高物质的释放，同时在有效的保持有效成分活性的同时又减少像蛋白质等杂质的析出，影响实验的结果，所以超声波法提取多糖是一种不错的方法。参考文献1 孟江，周毅生，廖华为.超声波提取鱼腥草多糖工艺研究.广东药学院中药学院，2008，19（1）：17-182张倩，江萍，秦礼康，等.鱼腥草水溶性多糖的提取及鉴定.食品科学，2000，21（3）：49-503罗馨，赵卫星，温普红.正交超声法提取鱼腥草多糖工艺研究.化学工程师，2012,09:10-154杨立红，林剑，黄清荣，等.阿魏菇深层发酵菌丝体多糖提取工艺优化研究.工业