细胞总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂盒

1、 细胞总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途 细胞总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂是一种旨在通过使用荧光素探针，受到有机氮自由基AAPH的破坏，但在抗氧化剂的存在下，得到抑制，由此通过荧光分光光度仪，观察其峰值下降程度的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox的总抗氧化能力，即消除自由基等值浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于适用于各种新鲜细胞样品总抗氧化能力检测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。技术背景超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化

2、氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；RO

3、S）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过氧自由基吸光能力（oxygen radical absorbance capacity；ORAC），即使用荧光素（fluorescein）作为探针，2,

4、2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride；AAPH）作为过氧自由基供体（peroxyl radical donor），其攻击探针，产生荧光淬灭，一旦受到抗氧化剂作用，而防止荧光消失，由此评价抗氧化潜力和活性，也就是自由基去除作用（free radical scavenging），在荧光分光光度仪（激发波长485nm20，散发波长528nm20）的帮助下，观察其峰值下降程度的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。产品内容 清理液（Reagent A） 300毫升 低渗液（Reagent B） 25毫升 缓

5、冲液（Reagent C） 4毫升 染色液（Reagent D） 7.5毫升 氧化液（Reagent E） 1管 标准液（Reagent F） 200微升产品说明书 1份保存方式保存 清理液（Reagent A）、 低渗液（Reagent B）和 缓冲液（Reagent C）在4冰箱里，其余的保存在20冰箱里，避免光照；有效保证6月用户自备15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5毫升离心管：用于标准样品配制的容器4（微型）台式离心机：用于样品操作细胞刮脱棒：用于脱离细胞超声仪：用于破碎细胞200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析实

6、验步骤 一、 样品准备1 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）2 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面3 小心抽去清理液4 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）5 加入2毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞6 移入到预冷的2毫升离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）7 放进4台式离心机离心5分钟，速度为300g8 小心抽去上清液 9 加入500微升 低渗液（Reagent B），混匀10 置于200瓦超声仪枪头下，离心管在冰槽里11 超声功率为100，猝击10秒，2个循环12 放进4微型台式离心机离

7、心10分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）13 移取上清液到新的4预冷的1.5毫升离心管14 移取10微升进行蛋白定量检测（建议使用 BCA蛋白质浓度定量试剂盒GMS30031.1）15 使用 清理液（Reagent A）调整蛋白浓度为100微克/25微升16 置于冰槽里待测二、标准液准备1 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管2 分别加入50微升 缓冲液（Reagent C）到2至5号管3 移取100微升 标准液（Reagent F）到1号管，混匀4 小心移取50微升1号管的 标准液（Reagent F）到2号管，混匀5 小心移取50微升2

8、号管稀释的 标准液（Reagent F）到3号管，混匀6 小心移取50微升3号管稀释的 标准液（Reagent F）到4号管，混匀7 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表管号 缓冲液（Reagent C） 标准液（Reagent F）测定体系标准 Trolox浓度10100微升1微摩尔/升250微升50微升 0.5微摩尔/升350微升50微升 0.25微摩尔/升450微升50微升 0.125微摩尔/升550微升00三、 样品测读实验开始前，将20冰箱里的试剂置于室温下融化，移取1.5毫升 缓冲液（Reagent C）到1管 氧化液（Reagent E）里，混匀，置于暗室里，标

9、记为 氧化工作液，避免光照。然后进行下列操作。1 准备1个黑色96孔板，做好标记：最大对照孔、标准样品孔、待测样品孔2 分别移取150微升 染色液（Reagent D）到黑色96孔板里的每个孔里3 加入25微升 缓冲液（Reagent C）到最大对照孔4 加入25微升上述配制的 标准液（Reagent E）到相应标准样品孔里5 加入25微升样品（100微克蛋白总量）到待测样品孔里6 放进37培养箱里孵育30分钟7 分别加入25微升 氧化工作液到标准样品孔和待测样品孔里 8 加入25微升 缓冲液（Reagent C）到最大对照孔9 轻轻摇动黑色96孔板，使其混匀10 放进37培养箱里孵育15分钟

10、11 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪里测读：激发波长485nm20，散发波长528nm2012 分析结果：1） 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为荧光单位；横座标（X轴）为标准Trolox浓度（微摩尔/升）2） 最大对照孔为最大荧光单位读数3） 标准样品孔和待测样品孔为实际荧光单位读数 4） 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）5） 计算样品实际总抗氧化能力 【根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）X 0.2（体系容量；毫升） X 样品稀释倍数】0.025（样品容量；毫升）（微摩尔/升TROLOX等值）6） 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）【实际荧光单位读数最大对照孔荧光单位读数】X 100 7） IC50：50抑制率所需的样品单位：TROLOX等值或样品蛋白量（毫克/毫升）或样品细胞量（106细胞） X（所需样品单位）（已知样品单位实际抑制百分率）X 50 注意事项1 本产品为50次操作，包括标准品2 本产品测试范围为100纳摩尔至1微摩尔Trolox等值3 操作时，须戴手套4 样品制备的所有操作均须在4状态下进行5 用户