大肠杆菌及其检验

1、大肠杆菌及其检验大肠杆菌的生物学特性· 简介：大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。附：肠杆菌科各属大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。· 形态与染色大小0.40.7×13um,无芽胞,大多数菌株有动力。有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌。附：有动力是什么意思？请看动力试验。革兰氏阴性杆菌是什么意思？请看革兰氏染

2、色介绍。大肠杆菌扫描电镜照片大肠杆菌透射电镜照片大肠杆菌分裂照片最新：大肠杆菌革兰氏染色照片· 培养特性由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37，在42-44条件下仍能生长，生长温度范围为15-46。在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：（1）光滑型： 菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。（2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。（3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于

3、8.0则生长缓慢。附：菌落形态有什么用处？菌落形态学生化反应大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。IMViC试验为“+、+、-、-”。即为典型大肠杆菌。· 抗原构造比较复杂，主要由菌体O抗原、鞭毛H抗原、夹膜K抗原组成。· 抵抗力该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55经60分钟或60加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。致泻性大肠杆菌简介大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引

4、起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（enterovirulentE. coli ）。一般包括四种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）致病性大肠杆菌（EPEC）出血性大肠杆菌（EHEC）侵袭性大肠杆菌（EIEC）。（1）肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli,ETEC）：引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性，一般23天即愈。营养不良者可达数周，也可反复发作。致病因素是LT或ST，或两者同时致病。有些菌株具有定居因子，常见者为O6：K15：H16、O25：K7：H42。鉴定ET

5、EC主要测定大肠杆菌肠毒素，血清型有一定参考意义。（2）肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E.coli,EPEC）:是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死；成人少见。细菌侵入肠道后，主要在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖。切片标本中可见细菌粘附于绒毛，导致刷状缘破坏、绒毛萎缩、上皮细胞排列紊乱和功能受损，造成严重腹泻。EPEC不产生LT或ST。有人报道，EPEC可产生一种由噬菌体编码的肠毒素，因对Vero细胞（绿猴肾传代细胞）有毒性，故称VT毒素。VT毒素的结构、作用与志贺氏毒素相似，具有神经毒素、细胞毒素和肠毒素性。鉴定EPEC可根据临床表现与血清型。(3)肠侵

6、袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E.coli,EIEC）:EIEC的多数菌株无动力，生化反应和抗原结构均近似痢疾杆菌，应予注意。（4）肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli,EHEC）:引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。EHCO的主要菌型是O157：H7，还可有O26、O等。附：肠出血性大肠杆菌O157:H7介绍。此外，肠粘附性大肠杆菌（Enteroadhesive E.coli,EAEC）也可引起腹泻，但对其发病机理与血清型尚不了解。EAEC不侵入肠上皮细胞，不产生LT或ST，也无VT毒素。唯一特征是具有与Hep-2细胞（人喉

7、上皮细胞癌细胞系）粘附的能力，故也称Hep-2细胞粘附性大肠杆菌。表：引起急性腹泻的大肠杆菌肠产毒性大肠杆菌 肠致病性大肠杆菌 肠侵袭性大肠杆菌 肠出血性大肠杆菌 感染部位 小肠 小肠 大肠 大肠 腹泻类型 水泻 水泻 痢疾样 血性腹泻 易感人群 婴儿，成人 婴儿 成人，儿童 各种年龄 分布 发展中国家(热带) 世界各地 世界各地 北美、日本 流行病学 散发或暴发婴儿腹泻及旅游者腹泻 散发或暴发婴儿腹泻 散发或暴发，常见于年龄较大儿童 起散发性或暴发性出血性结肠炎致病机理 LT、ST定居因子 细胞毒素定居因子 侵袭肠粘膜细胞 细胞毒素 常见O血清型 6、8、15、20、25、27、78、148

8、、159 2、26、44、55、86、111、114、119、125、126、127、128、142、146、158 28、29、112、124、136、143、144、152、164、167 O157：H7 鉴定 测定LT、ST、检出定居因子血清型 血清型与临床表现 血清型测定细菌侵袭力 血清型 大肠杆菌的检验方法 SN 016992出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法GB/T 4789.61994食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 以SN标准方法为例，进行说明。样品制备：以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均

9、质12min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10*-2、10*-3、10*-4。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。附：这是一种9管MPN法测定方法，什么是MPN法？LST和EC初步筛选：对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于36±1培养48±2h。观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气

10、的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5水浴箱内,培养48±2h。附：LST肉汤、EC肉汤有些什么？EMB平板：取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1培养24±2h。检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1培养1824h。附：怎样进行平板划线分离？平板划线示例EMB平板原理及照片生化试验：将斜面培养物

11、移种到下列培养基中进行生化试验。1色氨酸肉汤：在36±1培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.20.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。附：靛基质试验原理及照片2 MR-VP培养基：在36±1培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5-萘酚乙醇溶液0.6mL,40氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。附：MR-VP试验原理及照片3 Kos

12、er氏枸椽酸盐肉汤：于36±1培养96h记录有无生长。附：枸椽酸盐利用试验原理及斜面显色照片4 LST肉汤：于36±1培养48±2h,观察试管中是否产气。5革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：靛 基 质 MR VP 枸椽酸盐 鉴定(型别) 典型大肠杆菌 非典型大肠杆菌 典型中间型 非典型中间型 典型产气肠杆菌 非典型产气肠杆菌如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为或,再根据

13、LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。致泻性大肠杆菌的检验（GB方法简介）增菌以无菌手续称取检验25g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36±1培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42培养18h。分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1培养1824h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也

14、要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。附：麦康凯琼脂平板照片EMB平板原理及照片生化试验:自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI)。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36培养过夜。TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。附：三糖铁琼脂(TSI)原理及照片克氏双糖铁琼脂照片尿素酶试验原理及照片半固体培养基的作用？血清学试验

15、假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。证实试验：制备O抗原悬液，稀释至与Mac Farland3号比浊管相当的浓度。原效价为1：1601：320的O血清，用0.5%盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50水浴箱内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。附

16、：致泻性大肠杆菌及O血清。肠毒素试验（产毒素性大肠杆菌）（LT不耐热肠毒素，ST耐热肠毒素）1酶联免疫吸附试验检测LT和ST。2双向琼脂扩散试验检测LT3乳鼠罐胃试验检测ST附：肠毒素试验结果报告综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。 大肠杆菌 O157:H7的检验出血性大肠杆菌O157:H7介绍 1、培养基制备：改良EC新生霉素增菌肉汤 （mEC）：EC肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素，使终浓度为20g/mL。 改良山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）：山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液，使终浓度2.5mg/L，头孢克污，使终浓度为0.05mg/L。MUG

17、-LST肉汤：LST肉汤中添加4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使终浓度为0.1g/L。2、增菌培养秤取25克样品放入225mL mEC中，均质。于41±1培养18-24小时。3、分离将mEC肉汤培养物10倍递增稀释。从10-4，10-5，10-6稀释度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1培养1824小时。可疑 EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心，直径约2mm。附：在梅里埃公司改良山梨醇麦康凯琼脂上的菌落。4、鉴定挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接种MUG-LST，于36±1培养1824小时，出现产气，

18、且无荧光者，分离到普通营养琼脂。对纯菌落用EHEC O157:H7标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验，必要时进行生化试验。在检测过程中，也可以在选择性增菌后，取出5mL增菌液，经100水浴15分钟灭活后，供自动酶联荧光免疫测试（VIDAS），迅速获得初步结果，阳性反应者需作进一步证实。附:自动酶联荧光免疫测试（mini-VIDAS）自动酶联荧光免疫测试（VIDAS）测定程序· EHEC O157:H7检验程序图解检样25gmEC225mL VIDAS快速筛选41±1，18-24h10-4，10-5，10-6稀释度涂布TC-SMAC36±1，18-24h挑取5-10个

19、可疑菌落接种MUG-LST36±1，18-24hMUG阴性培养物转种普通营养琼脂生化反应鉴定 血清凝集鉴定或胶乳凝集试验用上述方法在样品中分离获得的纯菌落，经抗E.coli O157:H7标准血清或EHEC O157:H7胶乳凝集测试为阳性者，报告检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。如需要进一步检测Vero毒素基因的存在，可通过接种Vero细胞或Hela细胞，观察细胞病变进行判定，或可使用基因探针检测和聚合酶链反应（PCR）检测法。（参见FDA细菌分析手册第8版）染色技术 由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的

20、明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。本节包括四部分：一、染色的基本原理二、染料的种类和选择三、制片和染色的基本程序 四、染色方法一、染色的基本原理微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易

21、吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附。但是，要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生。相反，碱性物质（如细胞质）通常仅能染上酸性染料，若把它们变为适宜的物理形式，也同样能与碱性染料发生吸附作用。细菌的等电点较低，pH值大约在25之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。影响染色的其它因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的

22、通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。此外，培养基的组成、菌令、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染色。二、染料的种类和选择染料分为天然染料和人工染料两种。天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等，它们多从植物体中提取得到，其成分复杂，有些至今还未搞清楚。目前主要采用人工染料，也称煤焦油染料，多从煤焦油中提取获得，是苯的衍生物。多数染料为带色的有机酸或碱类，难溶于水，而易溶于有机溶剂中。为使它们易溶于水，通常制成盐类。染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质，分为酸性染料、碱性染料、中性（复合）染料和单纯染料四大类。1、酸性染料这类染料电离后

23、染料离子带负电，如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等，可与碱性物质结合成盐。当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色。2、碱性染料这类染料电离后染料离子带正电，可与酸性物质结合成盐。微生物实验室一般常用的碱性染料有美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等，在一般的情况下，细菌易被碱性染料染色。3、中性（复合）染料酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性（复合）染料，如瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等，后者常用于细胞核的染色。4、单纯染料这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质生成盐，其染色能力视其是否溶于

24、被染物而定，因为它们大多数都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如紫丹类（Sudanb）的染料。三、制片和染色的基本程序微生物的染色方法很多，各种方法应用的染料也不尽相同，但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。1、制片在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可。2、自然干燥涂片最好在室温下使其自然

25、干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。3、固定标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：）杀死微生物，固定细胞结构。）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过34次，共约23秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60）,放置待冷后，进行染色。以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍，但

26、是应当指出，在研究微生物细胞结构时不适用，应采用化学固定法。化学固定法最常用的固定剂有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，12%的饿酸等。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常用。应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的12%饿酸溶液，同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片，然后把培养皿盖上，经过12分钟后把标本从培养皿中取出，并使之干燥。4、染色标本固定后，滴加染色液。染色的时间各不相同，视标本与染料的性质而定，有时染色时还要加热。染料作用标本的时间平均约13分钟，而所有的染色时间内，整个涂片（或有标本的部分）应该浸在染料之中。若

27、作复合染色，在媒染处理时，媒染剂与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力。一般固定后媒染，但也可以结合固定或染色同时进行。、脱色用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌。常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液。、复染脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被脱色部位形成鲜明的对照，便于观察。革氏染色在酒精脱色后用番红，石碳酸复红最后进行染色，就是复染。、水洗染色到一定的时候，用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。、干燥着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片

28、翻转，以免将菌体擦掉。、镜检干燥后的标本可用显微镜观察。综上所述，染色的基本程序如下：制片固定媒染染色脱色复染水洗干燥镜检。四、染色方法微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用。故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。食品微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法。、单染色法用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。在一般情况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。使用酸性染料时，必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料染色。单染色一般要经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤。染色