动态评价联合检测乙肝病毒前S1抗原与核心抗原的临床意义.docx

1、F5八,、L八八八X.、Kf*,.八K.W、.f.r.W、.、H,*'-*',f、A*,-*'»*-.、人,.f"rtV/；?;?KXJOt«4?XrtXXXXXKzzi?irz*rrz.ir-,；*.-zzxzr.-z.-.-z.z.zz.r；%/.；r.-z.Hi-ra动态评价联合检测乙肝病毒前S1抗原与核心抗原的临床意义华中科技大学同济医学院附属同济医院王坤田德英章述军周健夏宁邵I黄元成.，武汉430030摘要目的：探讨联合检测乙肝病毒前S1抗原和核心抗原与HBVDNA的关系以及在乙肝诊疗中的意义。方法：对100例慢性乙肝患者的346

2、份系列血清和486例正常对照血清采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)进行DNA定量检测，酶联免疫吸附试验(ELISA)进行乙肝病毒前S1抗原和核心抗原的联合检测(检测结果以HBVNRAg表示)及对乙肝血清标志物进行定性检测。结果：342份HBVDNA(+)的血清中，有338份HBVNRAg检测为阳柱，灵敏度为98.8%(95%CI：0.9700.995),HBVNRAg#异度为99.6%(95%CI：0.9850.999)。45例患者的系列血清HBVNRAg的OD均值随着HBVDNA拷贝数降低而下降,且其有一定的相关性(r=0.721).其中有两位患者的血清标本出现了HBVDNA阴转。此外在

3、46例不明原因肝功能不良患者中，发现3例HBsAg(-),HBVDNA(+)的慢性乙肝患者。结论:联合检测乙肝病毒前S1和HBcAg不仅能反映乙肝患者体内HBV复制情况，而且对抗病毒药物在临床的使用具有一定的指导作用。关键词乙型肝炎病毒前S1抗原核心抗原HBVDNA中图分类号R512.6文献标识码AClinicalSignificanceofDynamicEvaluationofCombinedDetectionofHepatitisBVirusPreSIAntigenandCore/nti-genWANGKun-,TIANDeying,ZHANGShujun»etal.Tongji

4、HospitalAffiliatedtolongiMedicalCollege,HuazhunRUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,C/ii泌AbstractObjective：ToexplorethecorrelationofcombineddetectionofPreSiantigenandhepatitisBcoreantigenwithHBVDNAaswellasitssignificanceindiagnosingandtreatinghepatitisB.Methods：HBVDNAinserumsamplesfrom100ch

5、ronichepatitispatientsand486normalcontrolsweredetectedbymeansofQuantitativeReal-TimeTaqManPCR(FQ-PCR),HBVPre-SlcombinedwithHBcAgandhepatitisBserummarkersweredetectedbyHBVNRAgELISA.Results：Among342serumsampleswithHBVDNA(+),338casesshowedHBVNRAgpositive,thesensibilityofHBVNRAgwas98.8%(95%CI：0.9700.995

6、),thespecificitywas99.6%(95%CI：0.9850.999).Meanopticaldensity(OD)ofHBVNRAgdecreasedasthelevelofHBVDNAdroppedin45patients*andhavesomerevelance(r=0.721).HBVDNAbecamenegativeinserumsamplesof2patients.Inaddition,3caseswithchronichepatitisBwerefoundtohaveHBsAg(-)andHBVDNA(+)in46caseswithunexplainedliverd

7、ysfunction.Conclusions：CombineddetectionofHepatitisBvirusPreSiantigenandcoreantigennotonlyreflectsthereplicationofHBVinpatientswithhepatitisB,butalsoshowsguidingsignificanceforclinicalapplicationofantiviraldrugs.KeywordsHepatitisBvirusPreSiantigenHepatitisBcoreantigenHBVDNA长期以来，HBVDNA是判定乙肝患者是否具有病毒复制

8、及传染性的金标准。近年来由于HBV变异株的出现，导致HBeAg(-)、HBVDNA(+)的慢性乙肝患者所占比例较前明显升高。从而降低了HBeAg作为临床上评价病毒复制的价值。有实验数据显示:采用双抗体夹心ELISA法联合检测HBV前S1和核心抗原，其检测结果和荧光1厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,通讯作者：黄元成,E-mail：tjhych定量PCR检测结果符合率较高，并能有效检出由于前C基因变异导致的HBeAg(-).HBVDNA(+)和S基因“a”表位变异导致的HBsAg(-的乙肝患者。为进一步探讨联合检测HBV前S1和核心抗原的临床意义,我们对100例慢性乙肝患者的系列

9、血清进行了检测，以探讨其临床应用价值。资料与方法标本来源收集2007年6月2008年5月我院住院的100例慢性乙肝患者(男68,女32)的系列血清共346份，年龄1870岁，平均(44±8)岁。系列血清入选标准：FQPCR检测HBVDNA>104copies/ml,ALT为80200U/L,既往未行抗病毒治疗(包括核昔类似物及干.扰素)，现拟以核昔类似物抗病毒治疗，采集患者用药前1次和用药后连续至少2次.采集间隔(10±3)d。46例不明原因肝功能不良患者血清标本(男29,女17)。未分型肝炎入选标准:经检测HBsAg(-),抗-HCV(-),抗-HAV(-),抗-H

10、EV(-)，肝功能反复异常>6月，排除慢性酒精性肝炎，非酒精性脂肪肝，药物性肝炎，自身免疫性肝病，遗传性肝病等。正常对照血清486份,来自感染科门诊和体检中心，均经ELISA法检测为HBsAg(一),FQPCR检测HBVDNA<103copies/ml。标本采集方法:空腹条件下抽取静脉血5ml,4000r/min,离心10min,分离血清12ml,-70*C下保存，半年内检测。诊断标准参照2000年9月西安中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案沪。试剂和方法采用ELISA法对HBV血清学标志物进行检测，试剂购自上海科华生物技术有限公司,仪器为Ali

11、ceQualitysystem全自动分析仪。HBsAg、HBsAb、HBeAg的判定为样品OD值阴性对照均值的2.1倍为阳性。HBeAb.HBcAb的判定为样品OD值<CutOff值为阳性。所有具体操作均严格按照说明书进行，并同步做质控。采用FQ-PCR方法对HBVDNA进行检测,试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，仪器为德国Roche公司生产的LightCycler自动荧光PCR仪，所有具体操作均严格按说明书操作。检测下限为1X伸copies/ml,以多区段巢式PCR作为HBVDNA金标准。检测方法：以蛋白酶K法提取.采取适当引物进行巢式PCR。程序如下：95C10min,95*C

12、40s,53'C40s,72C40s,35个循环(第2轮25个循环,退火温度升至55C)。S区外侧引物aF1：5'-GTCTGCGGCGTTTIArC-3和aRl：5'-ACAGTGGGGGAAAGC-3,内侧引物aF2：5'-TGC-CCGTTTGTCCTCIA-3和aR2：5Z-AGAAACG-GRCTGAGGC-3(产物约2(X)bp)。前C区外侧引物pcFl：5'-CACCTCTGCCTAATCArCTC-3和pcRl：S'-ATGCTCAGGAGACTCIAAGG-3，内侧引物为pcF2：SACTGTTCAAGCCTCCAAGCT-3和

13、pcR2：5'-AAGGAAAGAAGTCAGAGGC-3'(产物约120bp)。引物均为上海英骏公司合成。采用双抗体夹心ELISA法检测HBV前S1和HBcAgCHBVNRAg)酶标板预包被抗前S1和HBcAg单抗,CUTOFF=0.12+阴性对照OD均值,结果以HBVNRAg表示。阳性表示血清中前S1和/或HBcAg阳性。试剂盒由厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心研制，北京万泰生物药业有限公司生产。统计学处理采用SPASS13.()软件进行统计分析,率的比较采用F检验，一致性比较采用Kappa检验，以PV0.05为差异有统计学意义;组间的两两比较采用廿分割法，

14、并以公式a'=a/2(k-l)估计检验水准。结果灵敏度和特异性346份血清中，HBVDNA>103copies/ml者共328份。对18份HBVDNA阴性标本行多区段巢式PCR检测，其中14份血清HBVDNA阳性。在此342份HBVDNA阳性血清中，338份标本HBVNRAg阳性，灵敏度为98.8%(95%C/：0.9700.995)。486份正常对照血清标本进行HBVNRAg检测，有4份HBVNRAg阳性，其中2份经多区段巢式PCR验测为HBVDNA阳性，特异度为99.6%(482/484)(95%CL0.9851.999)。HBVDNA拷贝数和HBVNRAgOD均值相关性比较

15、10()例慢性乙肝患者的血清标本中(共346份)，有45位患者(共159份)所测NRAgOD值随HBVDNA拷贝数的降低而下降。在此159份标本中，HBVNRAgOD均值和HBVDNA拷贝数具有一定的相关性/=0.721,见表1,图1。表1系列血清标本分组分组nHBVDNA(copies/ml)1组270IO，2组711伊10s3组48IO'伸4组13>1俨坦企Qoo><a:N>COH坦企Qoo><a:N>COH卜I1组2组3组4组HBVDNA(copies/ml)困IHBVDNA拷贝数和HBVNRAgOD均值相关桂比较HBVNRAg与HBVD

16、NA的一致性本研究检测的832份血清标本中，HBVNRAg与HBVDNA的总符合率为97.3%,Kappa值0.945(Kappa>0.75),见表2。表2HBVNRAg与HBVDNA的检浏结果HBVDNA-+HBVNRAg合计+324432818486504合计340490832不同HBV标志物模式中HBVNRAg和HBVDNA的检出率HBVNRAg在HBsAg阳性的标本中检出率为98.3%(340/346),HBeAg阳性率为37.9%(129/346),而HBVDNA阳性率为98.8%(342/346),差异有统计学意义(x2=115.07,PV0.05)e各种模式HBVNRAg阳

17、性率之间，HBVDNA阳性率之间均无显著性差异(廿=5.474,P>0.05；廿二o.678,P0.05),见表3。HBVDNA拷贝数与HBVNRAg及HBeAg之间的关系在346份血清标本中，随着血清HBV表3HBVNRAg和HBVDNA在不同HBV-M模式中的检出带况HBV-M模式例教HBVNRAg(+)HBVDNA(+)n%n%n%HBsAg(+)+HBeAg(+)+HBcAb(+)12937.312697.712899.2HBsAg(+)+HBeAb(+)+HBcAb(+)11232.410997.311098.2HBsAg(+)+HBcAb(+)9527.5951009498.

18、9HBsAg(+)+HBeAb(+)或HBsAg(+)102.899010100合计3461003-M)98.334298.8DNA拷贝数的升高，HBVNRAg阳性率亦随之升高,差异有显著性(=35.099,P<0.05)o进行组内两两方差分析示，当HBVDNA>103(copies/ml)时，其阳性率之间，差异无显著性(P>0.007)。当HBVDNA<103(copies/ml)时,其阳性率与其他各组比较,差异有显著性(廿=9.321,PV0.007；x2=31.386,P<0.OOTjx2=11.118,P<0.007)。在HBVDNA>K)3(

19、copies/ml)的血清中，HBeAg的阳性检出率仅为38.3%,见表4。表4HBV仍A餐量与HBVNRAg比技HBVDNAZ例数HBVXRAg(+)HBeAg(+)(copies/ml)n%n%n%>1俨3911.339100-1641.110510s18152.318099.4-8245.3UP10510831.210597.2,2624.10-103185.21477.8422.2注:组间的两两比较采用Z2分割法，以公式a'=a/2(k-l)估计检验水淮，得a'=0.007,与01相比较，PV0.007HBVNRAg对不明原因肝功能不良患者的检测46份不明原因肝功

20、能不良患者血清中，3份HBVNRAg检测为阳性，其OD值分别为0.341、0.475、0.145。均值仅为0.32。后对此3份标本进行重复HBVDNA多区段巢式PCR检测，证实为HBVDNA(+),HBsAg(-)的慢性乙肝患者。讨论临床上常通过检测乙肝血清标志物，尤其是HBsAg和HBeAg,来判断病毒的复制情况方】。近年来,随着乙肝疫苗、核昔类似物的长期临床应用,出现部分病毒基因组前C区或C区启动子变异，致使HBeAg的形成和分泌发生障碍。形成一部分HBeAg阴性而体内仍然存在病毒复制的慢性乙肝患者。据报道亚洲地区平均50%的HBeAg阴性的慢性乙肝患者存在C区突变闫。并且证实此类患者更易

21、发展至慢性乙肝，部分最终可演变为肝硬化甚至肝癌有报道证实利用生物探针杂交法检测发现乙肝病毒前S1抗原的表达与HBeAg,HBV-DNA的表达相平行。前S1抗原主要存在于Dane颗粒区带是HBV外膜蛋白最前端的一部分。Yuki等引报道前S1抗原与HBV的复制指标具有较好的一致性，并旦前S1抗原在患者血清的阳性率可达75%口2】。通过对乙肝病毒前S1抗原的检测可间接的反映患者体内HBV的复制情况，却不能避免由于HBsAg%”抗原表面的变异，而导致的HB-sAg(-),HBVDNA(+)乙肝患者的漏检。乙肝病毒核心抗原(HBeAg)是Dane颗粒的重要结构蛋白，其血清内含量浓度与HBVDNA含量高度

22、相关。通过对HBeAg进行检测，可弥补乙肝病毒前(下转第145页)chickenandegg"question.NutrMetabCardiovascDis,2000,10：275.3 SarafidisPA,LasaridisAN.Insulinresistanceandendothelin：anotherpathwayforrenalinjuryinpatientswiththecardiomcta-bolicsyndrome?JCardiometabSyndr,2008.3：183.4 MatherK,AndersonTJ.VermaSInsulinactioninthevas

23、culaturephysiologyandpathophysiology.JVaseRes,2001»38：415.5 HolzlB,IglsederB,StadlmayrA,etal.IntimamediathicknessofcarotidarteriesisreducedinheterozygouscarriersoftheGly972Argvariantintheinsulinreceptorsubstrate-1gene.EurJClinInvest,2003*33：110.6 Guerre-MilloM,GervoisP,RaspeE,etal.Peroxisomepro

24、lif-eratoractivatedreceptoralphaactivatorsimproveinsulinsens代iv-ityandreduceadiposity.JBiolChem,2000»275；16638.7 IdeT,ShimanoH,YahagiN»etal.SREBPssuppressIRSmediatedinsulinsignalingintheliver.NatCeilBioL2004»6：351.8 PollareT,LithellH,BcmeQInsulinresistanceisacharacteristicfeatureofpri

25、maryhypertensionindependentobesity.Metabolism,1990,39：167.(2008-12-14收私2009-04-02if®)(上接第134页)SI抗原由于变异而导致的漏检现象。本研究中342份HBVDNA(+)的血清中仅37.4%为HBeAg阳性，而HBVNRAg检测的灵敏度达98.8%。此外,通过对HBVNRAg和荧光定量PCR这两种方法进行比较，证实具有较好的一致性,总符合率达到97.3%(Kappa值0.945)。表明HBVNRAg对于判定乙型肝炎患者体内病毒是否复制优于HBeAg,与HBVDNA具有相似的临床价值。同时研究结果显示

26、HBVDNA拷贝数与HBVNRAgOD具有一定的相关性(r=0.721)o提示虽然HBVNRAg检测为一种HBVDNA定性检测方法，但可以通过分析其OD值的变化,对动态监测抗病毒疗效有一定的临床指导意义。本研究还发现，HBVDNA阴性时,HBVNRAg检测的阳性率较HBVDNA阳性时有明显下降(PV0.007)。可能是随着抗病毒药物的使用，虽然HBVDNA并未阴转，但大部分已接近临界值，故检出率降低。此外，对46例未分型肝炎患者血清标本进行检测，发现有3份HBVNRAgOD值为弱阳性。后经多区段巢式PCR检测证实，为HBsAg(-),HBVDNA(十)的乙肝患者。可能是HBVDNA低水平感染导

27、致抗原最过低或先天S基因和或前C区变异等引起。综上所述,对乙肝患者进行乙肝病毒前S1抗原和核心抗原的联合检测，不仅能准确的反映患者体内的病毒复制情况，而且能对部分变异株进行有效的筛查。对于目前HBVDNA定量检测尚未普及的情况下，可以补充常规以乙肝全套作为评价感染性的一些不足，在同等意义上讲，可以运用HBVNRAg来替代HBVDNA检测判定其感染性。参考文献1程钢，何笙韶，周新宇.荧光定量聚合酵链反应检*1乙型肝炎痛4.中华阪学检验杂志，1999,22:135.2成军.&充分重itHBeAgCT性慢性乙型肝炎患者的诊断与治疗.中华传染病杂志,2006,24：1.3JongeriusJM

28、,WesterM,CuypersHT.etal.NewhepatitisBvirusmutantfromablooddonorthatisundetectableinseveralhepatitisBsurfaceantigenscreeningassays.Transfusion.1998,38：56.4中华医学会.痛毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志，2000,8：324.5 TrepoC,ZoulimF,AlonsoC»etal.DiagnosticmarkersofviralhepatitisBandC.Gut,1993,34：S20.6 PetitMA.Buffello-I-cGuillouD,etal.ResidualhepatitisBvirusparticlesinlivertransplantsrecipientsreceivinglamivudinc：PCRquantit